发芽糙米糖蛋白抗炎、降血糖性能分析（一）

糖蛋白是发芽分析广泛存在于植物、动物和微生物机体内必不可少的糙米生物大分子，一般由多肽链和低聚糖链共价结合而成。糖蛋糖链影响多肽链或蛋白质的白抗折叠形态和整体构象。糖链与多肽链或蛋白质连接的炎降特殊结构使糖蛋白有多种存在形式，从而具有多种生物活性。血糖性糖蛋白具有预防肿瘤，发芽分析抗氧化，糙米降胆固醇，糖蛋提高机体免疫力等作用。白抗糙米发芽过程的炎降实质是糙米活化。发芽使糙米内部的血糖性多种酶被激发并且释放，从结合状态转化为游离状态，发芽分析释放出更多的糙米营养物质。发芽后的糖蛋糙米不仅含原有的肌醇六磷酸盐、膳食纤维、多种抗氧化物质以及游离态微量元素和多种维生素，还含有新生成的营养物质如γ-氨基丁酸等。其中蕴含的营养成分和活性物质显著提高，食用和保健功能大幅度增加。有研究表明，糙米发芽后，其糖蛋白性能也有所改变，糖蛋白含量随着萌发时间的延长而增加，且抗氧化性与萌发时间呈正相关。目前国内外对GBRG的相关研究鲜有报道。

本试验采取超声辅助提取GBRG，用DEAECellulose52阴离子交换层析法、SephadexG-200凝胶层析法分离纯化，对纯化的GBRG进行抗炎和降血糖性能分析。为进一步探寻消除炎症，改善胰岛素抵抗的天然药物功能性食品提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 发芽糙米粗糖蛋白样品制备

供试粳稻为“龙粳”，用龚谷机去除稻子外壳得到糙米，按照文献将糙米发芽并制备发芽糙米粗糖蛋白样品，冻干保存备用。

1.1.2 试剂

DEAE-Cellulose52，日本Pharmacia集团；脂多糖，北京索莱宝有限公司；硫酸、磷酸、乙酸、氯化铁、碘化钾、苯酚、硫酸铜、邻二氮菲、铁氰化钾、盐酸羟胺、邻苯三酚、硫酸亚铁、吡啶、乙酸酐、盐酸（分析纯）等，南京生物化学试剂研究中心；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖，上海和氏璧化工有限公司。

1.2 仪器与设备

680型酶标仪，日本Bio-Rad集团；CKX41型倒置显微镜，日本Olympus公司；Bj5060UV型CO2培养箱，美国Heraeus研究中心；DL-CJ-IN型超净工作台，南京医疗仪器制造中心；T25细胞培养瓶、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板，德国Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 发芽糙米粗糖蛋白的分离纯化

分离纯化流程GBRG粗品→上DEAE-Cellulose52阴离子柱→蒸馏水洗柱→氯化钠洗柱→绘制梯度洗脱曲线→洗脱峰透析、除盐、浓缩、冻干→溶于蒸馏水→上SephadexG200琼脂糖凝胶柱→氯化钠洗柱→确定梯度洗脱曲线→洗脱峰透析、浓缩、冻干备用。

每一步获得的GBRG均使用考马斯亮蓝法、苯酚-硫酸法检测其多糖及蛋白质含量。GBRG经DEAE-Cellulose52阴离子交换层析和SephadexG200琼脂糖凝胶柱层析，得到3个糖蛋白组分峰，分别命名为WEG、SEG-1和SEG-2。采用高效液相色谱、红外光谱、圆二色性、1H-NMR谱等方法进行结构分析，证明3个GBRG组分峰具有显著的糖蛋白特征。

1.3.2 GBRG的抗炎作用研究

1.3.2.1 细胞模型的建立

参照Xie等、Kim等的试验方法并加以调整，经100ng/mLLPS诱导RAW264.7细胞，建立细胞炎症模型。

1.3.2.2 MTT法测定细胞增殖活性

选用96孔培养板，分为3组：空白、对照、样品，3孔/组。将处于对数生长期的RAW264.7细胞配成浓度1×10⁵个/mL的细胞悬液，各孔添加100μL，进行培育，过夜待用。各组分GBRG溶于细胞培养液，终浓度为滤膜微孔过滤，混入100μL浓度不一的含GBRG的培养液，再把培养板放于37℃、CO₂体积分数5%的培养箱中，连续孵育24h，混入200μL5mg/mLMTT溶液/孔，培育4h。使用1mL注射器收集各孔中的上清液，与100μLDM-SO混合，振动摇匀8min使结晶物全部溶解，570nm检测细胞相对活力。

细胞相对活性=（样品组-空白组）/（对照组空白组）×100%

1.3.2.3 RT-PCR测定细胞因子TNF-α、COX-2、IL-1β和iNOS的表达

（1）细胞分组

将RAW264.7细胞接于96孔板（5×10⁵个/mL），划分成4组，培育过夜，各组包括3个重复孔。正常组：未加入LPS；LPS组：LPS质量浓度是1μg/mL；WEG糖蛋白组（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS；SEG-1糖蛋白组（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS；SEG-2糖蛋白组（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS。先向细胞中添加各浓度糖蛋白，1h后加入LPS孵化24h。

（2）引物设计

按照IL-1β、β-actin、COX-2、iNOS与TNF-α的基因序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。具体内容如表1所示：

（3）RNA提取

选择总RNA试剂盒用以提取RAW264.7细胞的总RNA，测定RNA浓度。

（4）逆转录反应

逆转录反应的试剂为50ng～5μg总RNA、1μL引物Oligo（dT）₁₈（0.5μg/μL）、10μL2×ES反应液、1μLRT/RI逆转录酶、1μLgDNA。将RNA模板、引物和DEPC水混合，65℃孵育5min后，冰浴2min，加入引物Oligo（dT）18，用于逆转录试验。42℃孵育15min，最后85℃孵育，使RT/RI与gDNA酶进行逆转录反应。

（5）PCR扩增

对逆转录所得到的cDNA进行PCR。在PCR管中加入SYBRGreen染料5μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、待测cD-NA5μL、DEPC水2.4μL。低速离心30s，使管内溶液完全混合，然后用RealtimePCR仪进行PCR扩增。反应条件为：94℃，5min预变性；65℃、2min，94℃、2min，共30个循环。

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