连翘叶乙醇提取物抗小鼠蓖麻油性腹泻活性及其对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响研究（二）

1.4 实验药品及试剂

碳酸氢钠、连翘离体氯化钾、叶乙硫酸镁、醇提葡萄糖、取物其对磷酸二氢钠、抗小空肠氯化钠、鼠蓖收缩氯化钙、麻油氯化铁、性腹泻活性及响研氯化铝、家兔肌自究醋酸钾[成都市科隆化学品有限公司]，平滑氯乙酰胆碱[成都华夏化学试剂有限公司（中国成都）]，发性蓖麻油（河南省华龙药业有限公司），连翘离体维拉帕米[Medchemexpress有限公司（美国）]，叶乙洛哌丁胺[西格玛化学公司（美国圣路易斯）]，醇提色谱乙腈（成都市科隆化学品有限公司），取物其对纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司），盐酸[成都市科隆化学品有限公司]、氯化铁、甲醇（重庆腾华化工有限公司）、醋酸钾和氯化铝用于粗提物的植物化学分析。蒸馏水（四川优普超纯科技有限公司）用于制备标准溶液、稀释液和生理盐溶液（Tyrode溶液）。

1.5仪器

家兔类通用实验器械，HW-400E恒温平滑肌槽（四川成都泰盟公司），BL-420F生物机能实验系统（四川成都泰盟公司），FT-100生物张力传感器（四川成都泰盟软件有限公司），优普纯水/超纯水制造系统（四川优普超纯科技有限公司），HH600-2B三用恒温水浴箱（金坛市科析仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（YDYQ,101-2A），粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司，FW177），电子分析天平（Mettle AE 240），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA），真空减压干燥箱（武汉奥普森试验设备有限公司，ZK 6050B）。

1.6 实验动物

选取110只健康昆明雌雄小鼠（18～22 g）以及42只健康家兔（2.0～2.5 kg），由川北医学院动物中心提供[许可证编号：SYXK(chuan)2013-076]，小鼠和家兔饲养于23～26℃、湿度适宜的实验室环境，12 h光照黑暗循环，期间可自由进食和饮水。本实验符合中国动物保护委员会的管理，并遵循动物伦理和实验准则。

1.7 实验方法

1.7.1 FS ext的急性毒性

取60只禁食4 h（可自由饮水）的小鼠随机分为0.5 g/kg FS ext试验组、1.0 g/kg FS ext试验组、2.0 g/kg FS ext试验组、4.0 g/kg FS ext试验组、8.0 g/kg FS ext试验组、16.0 g/kg FS ext试验组，每组10只，分别给予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0g/kg、16.0 g/kg的FS ext进行灌胃，处理后的小鼠可自由饮水进食，记录14 d内小鼠的死亡情况和毒性迹象，建立相应的剂量-效应曲线，从而确定FS ext的半数致死剂量（LD50），以确定其安全性[9]。

1.7.2 对蓖麻油性腹泻的影响

另取50只小鼠随机分成阴性组、阳性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组，每组10只，阴性组给予0.9%氯化钠溶液（20 ml/kg）灌胃，阳性组给予洛哌丁胺（4 mg/kg）灌胃，0.25 g/kg FS ext试验组、0.50g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组分别给予0.25、0.50、1.00 g/kg FS ext。给药30 min后，小鼠均给予蓖麻油0.4 ml灌胃，然后将每只小鼠放入单独的笼子中，地板衬有吸墨纸，将线网放置在离底部3 cm的笼中以使小鼠与吸墨纸隔开。观察4 h内以下指标：初始半固体粪便时间，固体、半固体、液体粪便数量。采用腹泻指数（EI）评估腹泻的严重程度。EI=固体粪便数量×1+半固体粪便数量×2+液体粪便数量×3。

1.7.3 离体标本制备

选取健康家兔，实验前禁食24 h，自由饮水。用木槌击致头昏，解剖家兔，以胃幽门与十二指肠交界处为起始部，取空肠并立即放入通有95%O2和5%CO2混合气的台氏液中，将内容物冲洗干净并剪去肠系膜，剪成1.5～2.0 cm数段，一端用线结扎固定于通气沟，另一端固定于张力换能器。给予前负荷1 g，浴槽内温度维持在（37.0±0.5）℃，通气沟以每秒1～2个气泡的速度持续通入混合气，待基线稳定后开始实验。

1.7.4 FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响

待空肠平滑肌张力稳定后，单剂量加入FS ext(0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，这些浓度是累加所得，即后一个的浓度由前一个浓度累加，主要目的是为了观察家兔离体空肠平滑肌自发性收缩随FS ext的浓度变化而变化的趋势），以给药前的张力为100%，记录给药后空肠平滑肌自发性收缩的张力变化。按照上述方法，用维拉帕米（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00μmol/L）处理家兔离体空肠平滑肌作为对照，记录给予维拉帕米后家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的张力变化。

1.7.5 FS ext对由乙酰胆碱（ACh）和KCl诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响

待空肠平滑肌张力稳定后，分别加入ACh(10μmol/L）和KCl(60mmol/L）预处理，出现最大波峰后，立即用台氏液冲洗肠管，等其稳定后，再次分别加入ACh(10μmol/L）和KCl(60μmol/L),15 min后，加入FS ext使其终浓度分别达0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00mg/ml，并记录空肠平滑肌自发性收缩稳定时的张力变化。按照上述方法，用维拉帕米（0.001、0.010、0.100、1.000、3.000μmol/L）处理家兔离体空肠作为对照，重复上述步骤，并记录此时空肠平滑肌自发性收缩稳定时的张力变化。

1.7.6 FS ext对由CaCl2诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响

为确定FS ext对Ca2+内流的影响，首先让肠管处于Tyrode溶液中，待其张力稳定后，将Tyrode溶液换为含EDTA的无Ca2+高K+溶液，持续30 min以从组织中除去Ca2+。再将溶液换为不含EDTA的无Ca2+高K+溶液，持续15 min，然后再加入FS ext(0.3、1.0 mg/ml），构建CaCl2(3×10-5～3×10-2 mol/L）的量-效曲线，观察给予不同剂量FS ext后家兔离体空肠平滑肌自发性收缩率的变化。在加入维拉帕米（1μmol/L）的情况下，构建CaCl2(3×10-5～3×10-2 mol/L）的量-效关系曲线，观察空肠平滑肌自发性收缩率变化。在没有FS ext和维拉帕米预处理的情况下，将3×10-2 mol/L CaCl2诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩率认为是100%[12]。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料以表示，组间比较用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 植物化学分析

2.1.1 初步植物化学分析

对FS ext的初步植物化学分析表明其含有酚类、皂苷类和黄酮类化合物。

2.1.2 总黄酮的含量

FS ext中黄酮含量的测定表明，黄酮含量为8.13 mg/g。

2.1.3 高效液相色谱法检测FS ext中的化学成分

采用高效液相色谱法对FS ext中的化学成分进行检测，结果显示，FS ext中主要含连翘苷和连翘酯苷A。在上述1.3.3的色谱条件下，连翘苷和连翘酯苷A的分离度良好，空白、混合标准品、样品的色谱图见图1。

2.2 FS ext的急性毒性

在测量LD50的实验过程中，小鼠按不同剂量的FS ext进行灌胃后，在观察期内未出现任何死亡或毒性迹象。单次给予FS ext的剂量为16g/kg，小鼠在观察期内未出现任何的死亡及行为变化。

2.3 FS ext对小鼠蓖麻油性腹泻的影响

5组初始半固体粪便时间和EI比较，差异有统计学意义（P<0.05）。阳性组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P<0.05);1.00 g/kg FS ext试验组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P<0.05）。阴性组EI高于阳性组、1.00 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P<0.05);0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组EI高于阳性组，差异有统计学意义（P<0.05，见表2）。

2.4 FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响

台氏液对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩无明显影响，差异无统计学意义（P>0.05，见图2）。FS ext对家兔离体空肠平滑肌表现出剂量依赖性解痉作用，即半最大效应浓度（EC50)=1.21 mg/ml(1.11～1.26mg/ml,n=6），见图3。图形类似于维拉帕米（0.01～10μmol/L），其EC50为0.51μmol/L(0.42～0.59μmol/L,n=6），见图4。

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