响应面法优化牛舌草多糖提取工艺及其对DNA氧化损伤的保护作用（一）

牛舌草为紫草科植物意大利牛舌草AnchusaitalicaRetiz．或琉璃苣BoragoofficinalisL．的面法地上部分，是优化艺及A氧我国新疆地区常用药材，牛舌草药材收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》维药分册，牛舌用于治疗心悸，草多失眠，糖提神志不安，取工其对头痛，化损反应迟钝，保护是作用爱维心口服液等制剂中的主药，同时，面法琉璃苣(BoragoofficinalisL．)也是优化艺及A氧一种可以食用的植物，其新鲜植物体可以作为蔬菜煮食，牛舌也可作为芳香调味料使用。草多研究表明，糖提牛舌草提取物具有抗氧化、取工其对抗癌、防治哮喘和阿尔茨海默病的作用，经预试验发现牛舌草含有丰富的多糖类成分，但目前未见深入研究报道。植物多糖具有多种生物活性，包括抗癌、降血糖等。本文着眼于对牛舌草多糖类成分的提取和含量测定，并研究了牛舌草多糖体外抗DNA氧化损伤作用，为将来进一步研究牛舌草的化学成分和药理活性奠定基础工作。

一、材料与方法

1、材料与试剂

牛舌草购自新疆维吾尔自治区维吾尔医院，由新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为紫草科植物琉璃苣BoragoofficinalisL。

葡萄糖对照品(SigmaG8270，纯度＞98％)；鲱鱼精DNA(北京索莱宝科技有限公司，生物试剂，纯度99.5％)；蒽酮(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，硫酸(天津市永晟精细化工有限公司，分析纯)；乙醇(天津市天新精细化工开发中心，分析纯)；蒸馏水(实验室自制，18.2MΩ·cm^-1)。

2、主要仪器设备

T6新世纪紫外可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；KQ-700DV型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-S4数显水浴锅(金坛医疗仪器厂)；ABl04—N型电子天平(Meller—ToledoInsterLTD)。

3、方法

（1）牛舌草多糖的制备

取牛舌草粉末经3倍量石油醚回流3次，每次3h，药渣挥干后用3倍量的95％乙醇回流3次，每次3h，药渣挥干后取0.5g加蒸馏水20mL超声提取3次，每次30min，提取液过滤合并后浓缩至10mL，Sevag法(氯仿：正丁醇5∶1)除去蛋白质，加无水乙醇至80％进行沉淀，离心后得到的多糖沉淀用无水乙醇、丙酮，乙醚反复洗涤后干燥，得精制多糖。

（2）葡萄糖标准储备液的配制

精密称取葡萄糖对照品50.05mg在50mL容量瓶中用蒸馏水溶解，随后定容至刻度，得葡萄糖对照品溶液，其浓度为1.001mg/mL的。

（3）标准曲线的制备

精密吸取葡萄糖标准储备液2、3、4、5、6mL分别置于25mL容量瓶中用蒸馏水定容，各取1mL系列葡萄糖标准溶液至具塞试管中，以1mL蒸馏水作空白，硫酸蒽酮一硫酸法显色，并在620nm处测定吸光度值，以葡萄糖对照品得浓度(mg/mL)对其吸光度A进行回归后得到标准曲线，回归方程为A=28.55C+0.0062，R²=O.9995，线性范围：0.01600—0.04800mg/mL。

（4）样品溶液的配制

将牛舌草药材粉末经3倍量的石油醚和3倍量的95％乙醇分别回流3次，每次3h，脱色并除去单糖和寡糖，挥干溶剂并干燥后精密称取药材粉末0.5g置锥形瓶中，加入蒸馏水20mL，超声提取30min，提取1次，离心得牛舌草多糖样品溶液。

（5）换算因子的测定

精密称取两份精制牛舌草多糖，各10mg，在50mL容量瓶中用蒸馏水溶解后定容至刻度，精密吸取该溶液0.5mL，将牛舌草药材粉末经3倍量的石油醚和3倍量的95％乙醇分别回流3次，每次3h，脱色并除去单糖和寡糖，挥干溶剂并干燥后精密称取药材粉末0.5g置锥形瓶中，加入蒸馏水20mL，超声提取30min，提取1次，离心得牛舌草多糖样品溶液。每份溶液测定3次并按下面的公式计算换算因子：

f=w/(C×D)，

式中：w为多糖质量，以mg计；C为多糖溶液中葡萄糖浓度，以mg/mL计；D为多糖稀释因素，取两者平均值，测得f=1.03。

(6)多糖含量的测定

精密吸取样品溶液1mL置于10mL容量瓶中并用蒸馏水定容，混匀，取该溶液0.5mL在具塞试管中显色，在620nm处测定吸光度。多糖含量=(c×D×f)/w×100％。其中w为多糖样品的质量，以g计；f为换算因子；C为多糖溶液中葡萄糖浓度，以mg/mL计；D为多糖稀释因素。

(7)精密度实验

精密吸取葡萄糖标准溶液4mL在25mL容量瓶中稀释定容，并取该溶液1mL在具塞试管中显色，重复测定6次，RSD为0.23％，表明仪器精密度良好。

(8)稳定性实验

按样品溶液制备方法制备一批样品，分别测定0、1、2、3、4、5、6h的吸光度，计算多糖含量，RSD为2.33％，表明样品溶液6h内稳定。

(9)重复性试验

根据精密吸取葡萄糖标准储备液2、3、4、5、6mL分别置于25mL容量瓶中用蒸馏水定容，各取1mL系列葡萄糖标准溶液至具塞试管中，以1mL蒸馏水作空白，硫酸蒽酮一硫酸法显色，并在620nm处测定吸光度值，以葡萄糖对照品得浓度(mg/mL)对其吸光度A进行回归后得到标准曲线，回归方程为A=28.55C+0.0062，R²=O.9995，线性范围：0.01600—0.04800mg/mL。项下的方法制备10份样品溶液，测定各溶液中的多糖含量，其RSD为2.11％，表明方法精密度良好。

(10)加样回收率试验

(11)响应面法优化实验设计

选取料液比，提取时间，超声功率，提取次数四个因素，在单因素实验的基础上利用Design—Expert8.0.6软件设计四因素三水平实验，各因素和水平如表2中所示，响应面设计和实验结果如表3中所示。

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