肠道集聚性大肠杆菌基因组脱氧核糖核酸提取方法比较与改进（三）

3.3全式金试剂盒提取集聚性大肠杆菌基因组方法优化

采用全式金细菌基因组DNA试剂盒标准提取方法中革兰氏阳性菌提取方法进行集聚性大肠杆菌基因组的肠道肠杆提取，并对提取方法改进。集聚菌基

第一步材料处理。因组在菌液的脱氧提重悬液中加入200μL RB11试剂（含溶菌酶4 mg）后在37℃的孵育时间由原来的1 h改为40min，加入蛋白酶K后在55℃的核糖核酸孵育时间由原来的15 min延长至30 min，洗脱后测定收集到溶菌酶裂解处理后的比较基因组DNA样品的纯度及浓度，见表6。改进由表可以看出，肠道肠杆经溶菌酶孵育处理后EAEC基因组DNA的集聚菌基提取量增大了近3倍。电泳分析结果如图3所示。因组由图可以看出，脱氧提所提取的核糖核酸基因组条带均一，无RNA污染。比较在提取过程中，改进加入试剂LB11与蛋白酶K经55℃孵育30min后，肠道肠杆菌液仍非常黏稠，因此推测EAEC菌体细胞成分较为复杂，可能是蛋白质含量较高，加入的蛋白酶K未能完全消化菌体蛋白，导致裂解液非常黏稠，不利于后续基因组DNA的提取，后续实验提高蛋白酶K的用量至40 mg/L。

增大蛋白酶K的用量后，菌体裂解液黏稠度明显降低，将其转移到吸附离心柱中离心后，液体易于通过吸附膜，因此，为了提高基因组的浓度，取3倍体积菌体裂解液用于提取基因组。表7为提高蛋白酶K用量后提取集聚性大肠杆菌基因组的纯度和浓度。由表可知，采用革兰氏阳性菌基因组DNA提取方法并增大1倍蛋白酶K的用量后，集聚性大肠杆菌基因组的浓度达到了197.7 mg/L，较标准方法提取的基因组的浓度增大了约14.5倍，但基因组纯度没有提高，推测所提取的基因组中仍有蛋白质等碳水化合物或无机盐、有机试剂的污染。由于所提取的基因组DNA用于制备定性核酸标准样品，因此模板DNA的纯度对聚合酶链式反应扩增基因组的特征基因时影响较小。琼脂糖凝胶电泳分析提高蛋白酶用量后的肠道集聚性大肠杆菌(EAEC)基因组结果如图4所示。由图可以看出，所提取的EAEC基因组条带明显，未见降解，无RNA污染，表明该优化方法能有效提高基因组DNA的浓度。

3.4集聚性大肠杆菌毒力基因PCR扩增检测

根据国家标准GB 4789.6—2016的方法，对所提取的集聚性大肠杆菌基因组进行检测。以所提取的集聚性大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增其特征基因astA、aggR、pic和uidA，并对其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图5所示。astA、aggR、pic基因为集聚性大肠杆菌的特征毒力基因，uidA基因可在97%的大肠杆菌内检测到，4个基因的检测结果均为阳性，PCR产物条带大小与目的片段大小相符，说明所提取的基因组确为集聚性大肠杆菌基因组。尽管所提取基因组的纯度指标A260/A2 8 0和A260/A2 3 0均未达到1.8，但是根据毒力基因扩增结果可知，所制备的基因组样品对于定性核酸标准样品的检测结果无影响，可用于制备定性核酸标准样品。

4结论

对比使用多种细菌基因组DNA提取试剂盒提取EAEC基因组的提取效果可知，由于EAEC细胞裂解液非常黏稠，不利于后续的基因组提取，因此提取到的EAEC基因组的浓度及纯度均非常低。4种试剂盒中全式金试剂盒提取步骤简便，耗时少，因此对该试剂盒提取过程进行优化。通过增加30 min的溶菌酶孵育、1倍蛋白酶K的用量及2倍体积的菌体裂解液，EAEC基因组的提取浓度提高了14.5倍，以所提取的基因组为模板，PCR检测EAEC的特征毒力基因，结果显示3个特征毒力基因均为阳性，满足用于制备食品检测用核酸定性参考物质的要求。本文中的研究为大量提取核酸定性标准样品的前期样品奠定了基础，同时也为基因组提取困难的细菌基因组的提取方法探索提供了参考。

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