太子参醇提物的肠道益生及增强抗氧化作用（一）

太子参为石竹科植物孩儿参的太参块根，全国各地均有种植，醇提肠道主要产自于福建、益生氧化江苏、及增贵州等地，强抗具有益气健脾，作用生津润肺之功效，太参已被卫计委确定列入“可用于保健食品的醇提肠道中药材名单”，以饮食养生为主的益生氧化药膳食用习惯更为普遍，具有良好的及增药用价值和保健作用。已研发生产典型的强抗药品、功能与保健食品有太子参复方颗粒、作用口服液、太参养生酒等。醇提肠道随着太子参生物活性研究的益生氧化不断深入，其在药品和功能食品方面的研究与应用前景广阔。已报道具有环肽、多糖、皂苷、氨基酸等多种活性成分，而关于太子参的功能研究则主要集中在太子参粗提物的心脏保护作用、降血糖、免疫调节和抗疲劳作用，但对肠道功能特性的研究较少有报道。

当机体细胞内的自由基累积到一定程度会破坏机体氧化/抗氧化的平衡，产生氧化应激，生物细胞内DNA、RNA、脂质和蛋白质等生物分子就会发生改变甚至被破坏，如DNA修复机制受到破坏从而增强DNA突变的产生，蛋白结构发生改变从而丧失蛋白质功能等，因此氧化应激与人类系统疾病的发生有着密切联系，而肠道作为物质吸收和能量代谢的主要器官，极易受到自由基攻击造成功能异常，影响机体代谢从而引发多种慢性疾病。许多研究已经证明肠道菌群能影响宿主的氧化/抗氧化水平，益生菌产生的超氧化物、过氧化氢酶及抗氧化代谢物，刺激宿主的抗氧化系统，可保护宿主细胞免受氧化应激等多种因素的影响，激活抗氧化信号通路。

本研究以太子参为原材料，通过实验室提取与初步纯化得到太子参醇提物，利用D-半乳糖致损动物模型初步研究太子参醇提物提高脏器抗氧化酶活的同时明确其对抗氧化相关肠道菌群具有积极作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

太子参购自福建咸康药业有限公司，粉碎过40目备用。清洁级ICR小鼠购自福建医科大学试验动物中心，许可证号为SCXK（闽）2016-0002。香草醛，α-萘酚阿拉丁试剂（上海）有限公司；冰醋酸，亚硝酸钠，苯酚，国药集团化学试剂有限公司；氯化铝，上海泰坦科技股份有限公司；Rb1标准品，安徽西青果生物科技有限公司；芦丁，北京索莱宝科技有限公司；D101大孔树脂，艾美科健（中国）生物医药有限公司。D-半乳糖，Sigma公司；注射用生理盐水，福州海王福药制药有限公司；蛋白定量测定试剂盒，总超氧化物歧化酶（T-AOC），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒，南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1780紫外分光光度计，日本岛津公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；N-1100旋转蒸发仪，FDU-1200冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；HL-2S恒流泵，上海泸西分析仪器厂有限公司；SpectraMaxPLUS酶标仪，美国MolecularDevices公司；MS3涡旋震荡，德国IKA公司；HeraeusFresco17离心机，ThermoFisherScientific公司；M199型切片刀，德国莱卡仪器（中国）有限公司；BMJ-A包埋机，常州中威电子仪器有限公司；BA210T型显微镜，Motic公司。

1.3 方法

1.3.1 太子参醇提物的制备

粉碎过40目筛的太子参按料液比1:8加入70%乙醇，60℃水浴锅中回流提取两次，每次1h，两次滤液合并于50℃旋蒸浓缩至1/4。太子参浓缩液用石油醚萃取后旋蒸去除石油醚，用水补足体积，稀释8倍后上大孔树脂D101，水洗至Molish反应至阴性，30%乙醇洗脱，收集洗脱液减压浓缩，冷冻干燥得粉末。

1.3.2 总糖、黄酮和皂苷含量的测定

1.3.2.1 总糖的测定

采用苯酚-浓硫酸法。取1mL样品溶液，加5%苯酚1mL，混匀后加5mL浓硫酸，混匀，室温避光反应30min后于490nm处测定吸光度。以葡萄糖为标品，绘制标准曲线。

1.3.2.2 黄酮的测定

参考KarenPitura等的方法测定，以芦丁为标准品，绘制标准曲线。

1.3.2.3 皂苷的测定

取适量样品溶液于10mL具塞试管中，60℃水浴挥干溶剂，加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8mL高氯酸，混匀，密塞水浴加热15min后冰水浴冷却，加入5mL冰醋酸，摇匀，于560nm波长处测定吸光度。以人参皂苷Rb1为标准品，绘制标准曲线。

1.3.3 体内抗氧化能力的测定

1.3.3.1 试验动物的分组与试验方法

72只雄性ICR小鼠（20±2g）适应性喂养3d后随机分为6组，分别为正常组（NC）、模型组（DG）、阳性对照组（PC）、低剂量组（LPEs）、中剂量组（MPEs）和高剂量组（HPEs），每组12只。除NC组外，其余各组每天颈后背皮下注射1000mg/kgD-半乳糖致氧化损伤，NC组注射生理盐水。LPEs组、MPEs组和HPEs组小鼠每天50、100、300mg太子参醇提物灌胃，PC组小鼠每日灌服50mg/kgVc，DG组和NC组每日灌胃等体积生理盐水，试验周期为5周。试验期间每天早上8:40～9:40称量体重，观察小鼠的一般体征。所有动物试验均遵照“试验动物护理和使用指南”进行，并得到福建省医科大学动物伦理委员会的审查和批准（编号：FJMUIACUC2019-0075）。

1.3.3.2 脏器指数的测定

试验周期结束后，小鼠禁食不禁水12～14h，摘眼球采血后颈部脱臼处死小鼠，迅速取出肝脏、肾脏、脑、脾脏，用预冷的生理盐水冲洗干净后用滤纸吸干，称重。计算公式为：

1.3.3.3 脏器抗氧化酶活性测定

CAT、SOD、GXH-PX和MDA的检测根据南京建成试剂盒说明书的要求进行，对小鼠肝脏、肾脏、脑部匀浆与血清抗氧化酶活性和MDA含量的检测。

1.3.3.4 肝脏切片

将小鼠肝组织用10%中性福尔马林固定然后用乙醇梯度脱水。二甲苯洗脱，然后依次在100%、95%、85%和75%乙醇，依次放置5min；再用蒸馏水浸洗5min，石蜡包埋，切片（5μm）。苏木素对肝组织进行染色5～10min，蒸馏水冲洗，伊红染3～5min，蒸馏水冲洗；梯度酒精（95%～100%）脱水，取出后置于二甲苯10min，重复操作2次，中性树胶封片，显微镜下放大100倍观察。

1.3.3.5 小鼠盲肠内容物的微生物分析

试验周期结束后，无菌环境取出小鼠盲肠内容物装入无菌冻存管，液氮速冻后置-80℃保存。使用TIANampStoolDNAkit试剂盒从小鼠盲肠内容物中提取微生物总DNA，对16SrDNA基因V3V4区进行扩增。扩增体系：5×reactionbuffer5μL，5×GCbuffer5μL，Dntp2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板2μL，ddH2O8.75μL，Q5DNAPolymerase0.25μL。PCR扩增参数：初始变性982min℃，变性9815s℃，退火55℃30s，引物延伸7230s℃，延伸725min℃，10Hold℃，25～30个循环，利用IlluminaMiSeq平台对群落DNA片段进行双端测序。

1.3.3.6 小鼠小肠组织形态

小心取出小肠，用预冷的生理盐水将内容物冲洗出来后放入中性福尔马林，用于病理切片分析。

1.2.3.7 数据统计分析

利用DPS7.5软件进行统计分析，测定结果以x±s（平均值±标准差）表示。采用单因素方差分析并用LSD法进行多重比较。

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