野生牛肝菌内生真菌分离鉴定及其生物学特性（二）

2 结果与分析

2.1 菌株的野生形态特征

从云南省2个地区采摘的3个种的野生牛肝菌子实体，共分离出可培养的牛肝内生真菌23株，通过菌落形态初步判断多数为木霉属，菌内菌分从中筛选出具有菌落形态、定及颜色、其生气味等差异大的物学4株菌种，接种于CPDA培养基上，特性在25℃下培养5d，野生平板生长的牛肝菌落形态、光学显微镜观察的菌内菌分菌丝、孢子形态，定及利用MoticImagesPlus2.0软件进行显微形态（10×100）拍摄，其生如图1所示，物学特征描述见表1。特性

2.2 4种内生真菌菌株ITS序列PCR扩增结果

进一步进行分子生物学鉴定，野生以引物ITS1和ITS4对内生真菌的DNA模板进行PCR扩增，获得4条长度均在410～610bp之间的特异性片段，4株内生真菌的ITS扩增产物电泳结果，如图2所示。
 

2.3 4种内生真菌菌株的系统发育树构建及分析

利用ITS通用引物对4株内生真菌进行序列扩增得到4条基因序列，序列长度分别是LCTG-12为580bp；LCCK-6为410bp；BSHC18为610bp；BBFO-10为600bp。将以上4条序列分别在NCBI库中进行在线BLAST比对，每种菌下载4～5条同源性高于95%的序列，以测序得到的基因序列为基础，同公共数据库下载的相似序列合并，采用MEGA-X软件，按照neighbor-joiningmethod，经过自举法1000次进行检验构建系统发育树，以此对菌株进行种水平的分类鉴别。4株菌在NCBI中BLAST比对结果显示：在100条序列比对结果中，LCTG-12与76株木霉属序列的序列同源性为99%以上，说明该菌为木霉属；LCCK-6与55株念珠菌属的序列同源性为90%以上说明该菌为念珠菌属；BSHC-18与50株菌寄生属的序列同源性为90%以上说明该菌为菌寄生属；BBFO-10与94株的序列同源性为99%以上。

系统发育树树枝的长短表示各菌株之间的遗传距离，同一支说明亲缘关系很近，以系统发育方法可以对关系较为密切的菌株序列进行较好的判别。结合形态学鉴定及BLAST对比及系统发育树结果：LCTG-12与NCBI数据库中的Trichodermagamsii聚类在同一支上，自检支持率100%，鉴定该菌为盖姆斯木霉；LCCK-6与Candidakruisii聚类在同一支上，自检支持率为100%，鉴定该菌为克鲁伊假丝酵母；BSHC-18与Hypomyceschrysospermus聚类在同一支上，自检支持率为100%，鉴定该菌为黄瘤孢菌；BBFO-10与Fusariumoxysprum聚类于同一株上，自检支持率达100%，鉴定该菌为尖孢镰刀菌。

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