栀子油中藏红花酸的提取及其HPLC法测定研究（二）

1.2.4 前处理方法

采用固相萃取法。栀油中藏

1.2.4.1 溶油试剂种类及料液比

称取0.5 g栀子油于烧杯中 ，红花分别加入5 mL正己烷、及其究DMF、法测石油醚、定研氯仿，栀油中藏将油完全溶解。红花活化：分别连续用5 mL甲醇和5 mL正己烷过二醇基SPE小柱。及其究上样：将油溶液过柱，法测此时待测物保留在固相上。定研用5 mL正己烷润洗烧杯2次，栀油中藏并将润洗液过柱。红花

淋洗：先用6 mL正己烷分2次清洗，及其究再用4 mL正己烷-乙酸乙酯（90：10）过柱。法测洗脱：最后用10 mL 100%的定研甲醇洗柱子。收集洗脱液，用甲醇定容到25 mL容量瓶中。分别取2 mL样液，经0.45 μm尼龙66滤膜过滤后，进行液相分析。选择好溶油试剂之后，再对料液比进行优化：分别加入2.5、5、7.5、10、12.5 mL的正己烷。

1.2.4.2 洗脱剂种类及浓度

固相萃取的洗脱剂种类选择及洗脱剂浓度优化方法，参照超声辅助液液萃取中的萃取试剂种类及浓度方法进行。

2 结果与讨论

2.1 藏红花酸的标准曲线

准确吸取藏红花酸标准储备液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，过膜，10 μL进样，分别测定其在440 nm检测波长的峰面积。以藏红花酸的浓度C为横坐标、该检测波长下测得的峰面积A为纵坐标，获得藏红花酸的标准曲线。结果表明，在上述浓度范围内线性良好，回归方程y=115356x—26489，R2=0.9996，按S/N=3计算，得到检出限为0.21 μg/mL，按S/N=10计算，得到定量限为0.7 μg/mL。

2.2 不同溶油试剂对提取栀子油中藏红花酸的影响

首先，在预实验中，无论是超声辅助液液萃取还是固相萃取都出现了一个共同现象，即石油醚和氯仿虽然都能溶油，但在液相检测时没有藏红花酸的信号峰。正己烷、石油醚、氯仿以及DMF的极性排序为：DMF>氯仿>石油醚>正己烷。这表明溶油试剂极性的大小并不是决定栀子油中藏红花酸提取效率的唯一因素，具体原因有待进一步研究。因此选择正己烷和DMF[18]进行后续实验。对超声辅助液液萃取，正己烷和DMF都有溶油效果，结果如图1所示，藏红花酸的出峰时间都在14.1 min附近，峰形良好且与周围杂峰都能较好分离。

此外，以DMF为溶油试剂得到的藏红花酸的信号峰比用正己烷得到的更高。经换算，用DMF溶解栀子油，检测得到的藏红花酸含量平均值为69.65 μg/g，比用正己烷为溶油试剂时获得的平均值（60.67 μg/g）高出8.98 μg/g。因此，对超声辅助液液萃取，DMF为最优溶油试剂。

实验未对固相萃取SPE小柱的填料进行优化，而是直接选择了二醇基SPE小柱。这是因为：首先通过预实验摸索不同SPE填料的检测效果（C18、硅胶、二醇基），发现二醇基的检测效果远远优于其他材料。其次，通过查阅文献，丁明等采用固相萃取测定茶油中总酚，比较不同的固相萃取小柱（C18、硅胶、弗罗里硅土以及二醇基），结果发现二醇基SPE小柱最好;罗凡等采用固相萃取/高效液相色谱法测定茶油中的多种天然酚类物质，直接采用了二醇基SPE小柱。

而藏红花酸和酚酸的性质类似，均为极性化合物，猜测其SPE的最优填料也为二醇基。综合考虑，实验中未对固相萃取的填料类型进行优化，而是直接选用了最优填料。对于固相萃取，实验结果表明：以DMF为溶油试剂，在洗脱液中检测不到藏红花酸的信号峰;以正己烷为溶油试剂时，可以检测到藏红花酸。这是因为，使用DMF为溶油试剂时，洗脱液的颜色几乎为透明，二醇基填料由原本的白色变为黄色，藏红花酸为黄色，所以它被大量吸附在二醇基填料中，几乎没有被洗脱下来。

推测其原因，可能是由于二醇基和DMF的极性都很强，二者之间具有强烈的相互作用，经过DMF溶解的栀子油，其中的藏红花酸与二醇基的相互作用变强，以至于不能被甲醇洗脱下来，液相上检测不到信号峰。因此，固相萃取选择正己烷为溶油试剂。

2.3 料液比对提取栀子油中藏红花酸的影响

超声辅助液液萃取的实验结果表明：随DMF体积逐渐增加，溶液逐渐浑浊，7.5 mL及其以上的溶液清澈度很低，不具有透光性。DMF体积在12.5 mL时，溶液离心后不分层。因此，DMF体积为7.5、10 mL和12.5 mL的样品不能进行液相分析。对2.5 mL DMF和5 mL DMF的栀子油萃取物进行液相分析，结果如图2所示：5 mL DMF时藏红花酸浓度平均值为69.65 μg/g，高于2.5 mL DMF时藏红花酸浓度平均值为59.93 μg/g。因此，在超声辅助液液萃取条件下，最优料液比选择0.5 g油：5 mL DMF。

如图3所示，固相萃取的结果表明：当料液比为油：正己烷=0.5 g：5 mL时，固相萃取得到藏红花酸浓度最高，为61.27 μg/g。

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