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多花指甲兰花粉活力及柱头可授性研究(一)

多花指甲兰为兰科指甲兰属附生草本植物,多花花型奇特,指甲柱状似“狐尾”,兰花力及花序密集,粉活花大部白色,可授稍有紫色点缀其间,性研观赏价值高。多花更重要的指甲柱是,多花指甲兰极具芳香,兰花力及独特的粉活芳香性状也是多花指甲兰的重要价值之一。其含有醛类、可授芳香族类、性研酯类、多花酮类以及萜类化合物等多种挥发性物质,指甲柱可广泛应用于化妆品、兰花力及美容等行业,近年,一家日本公司公布了其香水专利,构成其产品成分的一种主要香味物质便来自于此。同时,多花指甲兰也是重要的药用兰花,在印度东北部当地部落居民有使用指甲兰属植物治疗常见疾病的习俗,孟加拉国和泰国也有相关报道,国内研究人员也发现指甲兰属植物有作为抗癌药物潜能。多花指甲兰不仅拥有花型、花色和香味等众多优良性状,是不可多得的优秀亲本资源,而且在医药业、化工业也广泛运用,具有重大开发潜能。多花指甲兰常附生于乔木上,由于过度的资源开采、旅游开发等生态破坏行为,以及对其附生树种的乱砍滥伐、野生植物非法贸易,导致多花指甲兰野生种群的生存面临极大威胁。CITES(《濒危野生动植物种国际贸易公约》)将指甲兰属的所有种列入其附录Ⅱ的保护对象。我国也将其列入国家重点野生植物保护名录(第二批次)。我们应积极对其采取相关保护措施。但由于种质资源匮乏等原因,国内目前较少见到多花指甲兰的相关报道,花粉形态观察和花粉活力测定以及柱头可授性更是鲜有报道,还有极大的挖掘空间。

花粉和柱头具有较高的活性是杂交育种成功的关键,目前,国内外主要使用花粉染色法和花粉离体培养测定花粉活力。常见染色方法有醋酸洋红染色法、I2-IK染色法和TTC染色法。据文献报道,最符合真实值的方法为TTC染色法;而花粉离体培养是最能反映真实值的方法。柱头可授性均利用联苯胺-过氧化氢法测定。当前,仅有少数研究人员以市场上常见的几种兰花为材料进行了花粉形态、花粉活性以及柱头可授性的研究。褚怡等研究了大花蕙兰和几种国兰的花粉活力和柱头可授性,喻兰等对蝴蝶兰的花粉活力和柱头可授性进行了测定。罗远华等以20个文心兰种质为材料,对花粉活力进行测定。这些研究明确了各材料最佳的授粉时机,为兰花的杂交育种、引种栽培提供了理论指导。本文在前人的基础上对多花指甲兰的花粉形态、花粉活力以及柱头可授性开展研究,以期为多花指甲兰的杂交引入、迁地保护以及后续的应用开发提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来源于云南省澜沧县(99°29′E~100°35′E、22°01′N~23°16′N之间),为野生种,目前种植于海南大学育苗基地(20°03′N,110°19′E)。使用试剂为氯化三苯基四氮唑(TTC)、I2-KI以及醋酸洋红染液。试验器材为镊子、解剖针、解剖刀、盖玻片、载玻片、10mL离心管、恒温培养箱、光学显微镜(BA210-T)等。

1.2 方法

1.2.1 多花指甲兰花粉电镜扫描

采集花蕾期、盛花期、衰败期的多花指甲兰花粉(图1),经离子溅射仪喷金后,置于场发射扫描电子显微镜下观察(S-4800)。选取各时期花粉在30×、100×、500×的视野下观察并对各开花时期花粉块的形态结构进行拍照记录。

1.2.2 花粉活力染色测定

结合胡适宜与罗远华等的方法,并在此基础上进行优化,具体为用pH为7.2~7.4的10×0.01mol/L磷酸缓冲液配0.5%的TTC溶液、I2-KI以及醋酸洋红染液取不同开花时期新鲜花粉团,将花粉捣碎于载玻片上,用镊子与解剖针使之充分分散,然后滴加适量新鲜配制的TTC染色液、I2-KI以及醋酸洋红染液,盖上盖玻片,用锡箔纸包裹黑暗处理置于35℃恒温箱中。24h后在光学显微镜下观察统计花粉活力,每张片子随机计数5个视野的染色率,染成红色的为活力强的花粉,淡红色为活力弱的花粉,无活力或不育的花粉无法被染色。

1.2.3 花粉离体萌发

以钱鑫等、郭丽霞等的研究为基础对培养基进行优化,预实验结果表明,最适培养基为:20%蔗糖+20mg/L硼酸+10mg/LCaCl2,在25℃恒温中暗培养48h之后于光学显微镜下观察花粉萌发情况,以花粉管长度超过花粉粒直径的2倍为萌发标准,并选择3个视野进行计数。

1.2.4 柱头可授性检测

用联苯胺-过氧化氢法测定多花指甲兰柱头活性。联苯胺-过氧化氢反应液用1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22配制,现配现用。取不同开花时期的新鲜雌蕊柱头,放入培养皿中,加入检测液使之没过柱头,反应10min。在体视显微镜下观察气泡产生情况以及柱头变色情况。

1.3 数据处理

数据采用Microsoftoffice2010及GraphPadPrism8分析软件进行分析作图。

2 结果与分析

2.1 多花指甲兰花粉电镜扫描结果

与其他形态和生理特征相比,花粉形态保持相对稳定,因此花粉形态可以作为更好的分类和系统发育标记。多花指甲兰花粉团附着于有柄的粘盘上,花粉呈黄色,蜡质,2个。在扫描电镜下可以清晰的观察到每个具半裂的裂隙,表面稍有凹陷,无纹饰,近球形(图2A),粘盘柄狭长,粘盘较宽(图3A)。每个花粉团均由大量形状不规则花粉粒通过类脂质粘合而成。由图2~图4和表1可知,随着开花时间延长,花粉粒皱缩,体积变小,整个花粉团体积也相应变小,花粉团表面变得更加紧密平滑。尤其是开花10d后时,即衰败期,花粉粒表面致密平滑。

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