高盐稀态酱油中生物胺的差异性分析（一）

生物胺（biogenic amines，高盐BAs）是稀态一类低分子质量含氮有机碱，由动植物及微生物产生，酱油并且在自然界中被普遍发现。中生目前被发现的物胺BAs共有3大类，主要有脂肪族的异性腐胺（putrescine，Put）、分析尸胺（cadaverine，高盐Cad）、稀态精胺（spermine，酱油Spe）和亚精胺（spermidine，中生Spd），物胺芳香族的异性酪胺（tyramine，Tyr）和β-苯乙胺（β-Phenethylamine，分析β-Phe），高盐杂环族的组胺（histamine，His）和色胺（tryptamine，Try），以及近些年在章鱼唾液中被发现的章鱼胺。BAs本身在机体中发挥多种生理功能，是正常的活性物质，并在生命活动中起着重要作用。然而，身体对BAs具有一定的耐受力，当质量浓度过高身体就会出现偏头痛、胃部痉挛、呕吐、腹泻、过敏等中毒症状。食品及药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）指出食物中His质量分数超过500 mg/kg就会对人体健康构成威胁，质量分数达到800 mg/kg的Tyr是有毒的，食物中总胺质量分数范围不应超过1 000 mg/kg。BAs的形成主要与氨基酸的脱羧反应和醛的胺化反应有关。食品发酵过程中微生物代谢的氨基酸脱羧酶作用于多种氨基酸，使其脱去羧基形成BAs，这是发酵食品中BAs的主要来源。因此，氨基酸、微生物以及氨基酸脱羧酶成为BAs产生的必备条件。

调查发现，酱油、虾酱和干腌鱼等发酵食品中BAs水平较高。酱油是以大豆、小麦、面粉或麦麸为原辅料，通过微生物发酵得到的液态调味品，氨基酸较丰富。丰富的氨基酸为酱油提供独特鲜味的同时也为BAs的形成提供可能。再加上酱油发酵体系复杂，微生物种类繁多，不同微生物间的相互作用、代谢途径尚不完全明确，不能确切说明哪些参与了酱油发酵的微生物具有氨基酸脱羧酶分泌能力。酱油中常见的BAs有8种：Try、β-Phe、Put、Cad、His、Tyr、Spd和Spe，这使得酱油具有一定的健康风险，随着人们对健康生活的要求不断提高，酱油的食用安全性也得到了越来越多的关注。酱油在世界上占有重要地位并在我国市场上需求量大，因此，为消费者提供安全可靠的可食用酱油意义重大。本文以华南地区生产的高盐稀态酱油为主要研究目标，研究了高盐稀态酱油中8种常见的BAs，并分析了相同品牌的不同等级间、相同等级的不同品牌间酱油中BAs组分的差异。为华南地区酱油的食用安全提供依据，为酱油工业中BAs调控技术的研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料部分自购于广州市区各大小超市，部分取样于广州市如丰果子调味食品有限公司。

丹磺酰氯（纯度>99%）、BAs标准品、内标物（1,7-二氨基庚烷），Simga公司；乙腈、甲醇（色谱纯），迈瑞达公司；乙酸铵（色谱纯），麦克林公司；谷氨酸钠，美国MYM公司；碳酸氢钠，天津百世化工有限公司；氢氧化钠，广东铭固化学科技有限公司；37%盐酸、硫酸铵，天津福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱仪（配有紫外检测器），日本岛津公司；MD200型氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；涡旋振荡仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 BAs的测定

采用丹磺酰氯柱前衍生法，ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，内标法定量。

1.3.1.1 溶液的配制

根据YU等方法稍有改进，BAs标准混合使用液及标准系列溶液的配制：准确称取各BAs标品适量，于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，混匀，使质量浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L，临用现配。内标标准储备溶液及标准使用液的配制：准确称取内标标准品适量，用0.1 mol/L盐酸配制成内标使用液（100 mg/L），临用现配。

丹磺酰氯衍生剂溶液：取适量丹磺酰氯，以丙酮为溶剂配制质量浓度为10 mg/mL的衍生剂使用液，置4 ℃冰箱，避光储存。

1.3.1.2 样品及标准品的衍生

准确量取1.0 mL样品于15 mL离心管中，先后加入100 mg/L内标溶液250 μL、饱和碳酸氢钠溶液1 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液100 μL、衍生试剂1 mL，涡旋振荡，1 min后置于60 ℃恒温水浴锅中衍生15 min，取出，分别加入100 μL谷氨酸钠溶液，混匀，再置于60 ℃恒温反应15 min，取出冷却至室温，加入1 mL超纯水，涡旋振荡1 min，40 ℃氮气去丙酮（约1 mL），加入0.5 g氯化钠，涡旋振荡至完全溶解，再加入5 mL乙醚，涡旋振荡2 min，静置分层，转移上层乙醚于15 mL离心管中，下层再次萃取，合并2次乙醚萃取液，40 ℃水浴下氮气吹干。加入1 mL乙腈振荡混匀，使残留物溶解，0.22 μm滤膜针头滤器过滤，待测。相同方法衍生标准品溶液。

1.3.1.3 色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5-Micron），紫外检测波长：254 nm，进样量：20 μL，流动相A：90%乙腈/10%（含0.1%乙酸的）0.01 moL/L乙酸铵溶液，流动相B：10%乙腈/90%（含0.1%乙酸的）0.01 moL/L乙酸铵溶液，流速：1.0 mL/min。洗脱程序见下表1。

1.3.1.4 标准样品图谱

标准品衍生物图谱如图1所示，在上述梯度洗脱条件下，8种BAs衍生物分离效果佳，峰形较好。按出峰时间先后顺序各峰分别为Try、β-Phe、Put、Cad、内标物（1.7-二氨基庚烷）、His、Tyr、Spd和Spe的衍生物。

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