乳酸乳球菌胞外多糖提取纯化工艺研究（一）

乳酸乳球菌胞外多糖（EPS）为乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的乳酸乳球一类多糖类化合物。由于乳酸菌相比其他工业用菌安全性高，菌胞究故近年来对乳酸菌胞外多糖的外多研究也逐渐增多。从已有的糖提研究结果来看，合成EPS的取纯乳酸菌中乳酸乳球菌合成能力较强，为80～600mg/L。化工胞外多糖作为食品添加剂，艺研可用作多种食品的乳酸乳球增稠剂、稳定剂、菌胞究乳化剂和凝胶剂；具有生物活性如免疫活性、外多抗肿瘤和抗溃疡，糖提可应用于医药领域，取纯分子量大约为4.0×10⁴～6.0×10⁶之间。化工尽管长期以来研究者们对乳酸菌产EPS的艺研化学组成存在着分歧，但是乳酸乳球较一致认为：从乳酸菌中分离得到的胞外聚合物是由α-和β-连接糖重复单元所组成的多糖，并且不同乳酸菌分泌的EPS类型不同。虽然单糖组成可能有些相似，多为半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，但是各成分比率不同。由于发酵液中EPS的产量较低、蛋白质含量较高，给EPS的提取带来较大困难。因此，发酵液中提取EPS工艺关键即是蛋白质的除去与EPS的沉淀，可得到稳定、易使用、杂质少的多糖产品。本实验对乳酸乳球菌发酵液通过不同的条件进行提取纯化EPS，验证最佳除蛋白条件和多糖沉淀条件，为工业化生产乳酸菌胞外多糖奠定理论基础。

一、材料与方法

1、材料与试剂

乳酸乳球菌乳亚种LL9（以下简称乳球菌LL9）：郑州轻工业学院实验室提供，由乳酸乳球菌乳亚种6242（中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC））紫外诱变，经葡萄糖耐受及乳链菌肽耐受水平筛选挑出，比较生物活性最终筛出活性高、乳链菌肽产量高的最优化菌株。

分离纯化条件为：发酵液→添加三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min搅拌5min→4℃沉淀除蛋白20min→10000r/s离心20min除菌体→上清液透析12h→苯酚硫酸法测定EPS。可得乳酸菌胞外多糖的产量为262.63mg/L。

6%的苯酚溶液：精确称取6.0g重蒸酚晶体，用少量的蒸馏水溶解后倒入100mL的容量瓶中，定容、充分摇匀，倒入棕色试剂瓶中备用。

2、实验方法

（1）菌种活化

保存于甘油管中乳球菌LL9接种于MRS液体培养基内，37℃培养，传代2～3次后，染色镜检，挑选优良菌株，转接斜面培养，4℃冰箱冷藏保藏备用。

（2）摇瓶发酵

活化后菌液5%转入摇瓶发酵，37℃恒温150r/min震荡培养24h。

（3）发酵液处理

取发酵终点发酵液，10000×g下离心8min去除菌体，取上清液备用。

（4）苯酚硫酸法测定

EPS该方法较适合乳酸菌EPS检测，相对误差为0.2%，具有较好的准确性。透析液经稀释取2.0mL加入1.0mL6.0%的苯酚溶液，5.0mL95.0%的浓硫酸，静置10min，高速振荡器上振荡摇匀，静置20min至冷却。490nm测定OD值。标准曲线上查找对应糖含量，即得乳酸菌胞外多糖产量。

（5）提取纯化工艺流程

斜面→MRS液体培养基活化两次（37℃，24h）→摇床扩大培养（37℃，150r/min，24h）→离心去除菌体（5mL，10000×g，8min）→添加三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min搅拌5min→离心沉淀除蛋白（4℃，18000×g，30min）→上清加乙醇沉淀多糖（100%，3倍体积，4℃，处理12h）→离心（12000×g，30min）→冷冻干燥→沉淀温水溶解（稀释10倍）→透析MD34（4℃，处理12h）→苯酚-浓硫酸法测定OD值→EPS纯度鉴定

二、结果与分析

1、苯酚硫酸法标准曲线绘制

用葡萄糖作为标准物，绘制标准曲线。由图1可知，糖浓度在0～32mg/L时，糖浓度和透光度呈线性关系。

2、除蛋白条件优化

（1）除蛋白中三氯乙酸浓度的优化

将发酵液通过离心的方法除去菌体后，分别加入30%、40%、50%的三氯乙酸溶液1/5体积，探讨不同三氯乙酸浓度对蛋白质沉淀的影响，如图2所示。三氯乙酸浓度在30%～50%时与发酵液多糖产量呈正比关系，三氯乙酸浓度过高会对多糖的结构产生影响，因此初步确定除蛋白阶段三氯乙酸的最优浓度为50%。

（2）除蛋白中离心力优化

本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，分别在10000×g、12000×g、13000×g、16000×g离心力下离心30min，选取最优化离心条件，如图3所示。在离心力16000×g时，多糖得率达到最大值，选16000×g为最优离心力。

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