维氏气单胞菌中介导的群体感应现象及大蒜提取物的干扰作用（二）

1.3.6 生物膜形成能力的维氏测定

参照KuSada等的方法，采用结晶紫染色法分析大蒜提取物对细菌生物膜形成能力的气单群体取物影响。将细菌培养液按1∶1000的胞菌比例稀释，加入无菌96孔板中，中介加入不同浓度的导的的干大蒜提取物（终质量浓度为0.15～1.20mg/mL），30℃静置培养24h。现象移除培养液，蒜提用无菌去离子水冲洗3次，扰作无菌风干燥，维氏加入200μL0.1%结晶紫染色液，气单群体取物室温染色15mIn，胞菌无菌水冲洗3次，中介加入1mL95%乙醇漂洗生物膜，导的的干将洗液于波长570nm处测定OD值。现象

参照PackIavaThｙ等的蒜提方法，利用激光共聚焦显微镜（cLSm）分析细菌生物膜结构的变化。将细菌培养液按1%的比例接入含1mLLB培养基的24孔板中，加入1.20mg/mL大蒜提取物和直径为1cm的圆形盖玻片，静置培养24h。用无菌水轻轻冲洗玻片上未粘附的细胞，0.1%吖啶橙染色1mIn。洗去多余的染色液，将盖玻片置显微镜下观察。该显微镜装有激发波长为515～560nm的激发滤光器及60×（60倍）的油镜，其荧光显微镜照片与光镜照片均由FluovIewv5.0软件获得

1.3.7 基因表达量的测定

采用实时荧光定量PcR（RT-PcR）技术。细菌活化后加入1.20mg/mL大蒜提取物培养24h，利用细菌RnA提取试剂盒提取细菌RnA。在20μL反应体系中，加入10μL2×荧光定量PcR预混体系，0.4μL10μmol/L上、下游引物，2μLcDnA模板。PcR扩增程序为：预变性95℃3mIn，变性95℃7S，退火57℃10S，延伸72℃15S（45个循环）。相对表达量（RQ）由2-ΔΔcT方法计算得出。

1.3.8 细菌腐败能力的测定

参照Zhao等的方法制备无菌鱼糜肉汁。冷冻鱼糜解冻后，按质量比1∶1加水打浆，加热煮沸5mIn后静置，冷却至室温。用2层纱布过滤得鱼糜肉汁，加入1.6g/L氧化三甲胺、40mg/LL-半胱氨酸和40mg/LL甲硫氨酸，混合均匀后于121℃高压灭菌15mIn，得无菌鱼糜肉汁。无菌条件下，在鱼糜肉汁中添加不同质量浓度的大蒜提取物（终质量浓度为0.15～1.20mg/mL）。将制备好的细菌菌悬液接种至无菌鱼糜肉汁中，于30℃中摇床培养48h，每间隔6h取样，测定鱼糜肉汁中TVB-n和腐胺含量变化。

TVB-n的测定参照赵丹丹等的方法，取5mL样品，加入15mL0.6mol/L高氯酸溶液均质混匀，上清液用半自动凯氏定氮仪测定。腐胺含量的测定参照Zhao等的方法，取2mL样品，加入25mL0.4mol/L高氯酸溶液均质混匀，上清液用丹磺酰氯衍生后用高效液相色谱分析。

1.4 数据统计分析

运用SPSS21.0软件和OrIgIn8.5软件分析数据。测定结果以均值±标准差（n≥3）表示，采用最小显著差异法（LSD）进行显著性差异分析，显著性水平为5%。

2 结果与分析

2.1 维氏气单胞菌产AHLs信号分子的种类

以根癌农杆菌为报告菌，利用平行划线法分析维氏气单胞菌的AHLS分子产生情况，结果见图1。细菌产生的AHLS可通过琼脂扩散诱导根癌农杆菌产生β-半乳糖苷酶，并分解底物X-gal产生蓝色色素。由图1可知，维氏气单胞菌可产生AHLS类信号分子并诱导根癌农杆菌显蓝色。

根癌农杆菌对不同碳链长度或带有不同基团的AHLS分子敏感程度不同，这些AHLS经TLc展开，在培养基相应的位置诱导根癌农杆菌呈现蓝色斑点。根据斑点的比移值、形状和颜色深、浅可直观判断AHLS的种类及相对含量。对维氏气单胞菌的AHLS提取液的TLc分析结果见图2。分析可知，该细菌至少产生3种AHLS分子，即：c6-HSL、c7-HSL和c8-HSL。c4-HSL与c6-HSL是目前气单胞菌属报道最多的2种AHLS信号分子。LI等在腐败比目鱼中分离的温和气单胞菌中检测到c4-HSL、c6-HSL、c8-HSL、N-癸酰基-高丝氨酸内酯（c10-HSL）和n十二酰基-高丝氨酸内酯（c12-HSL）。本试验在维氏气单胞菌中检测到侧链上的碳原子数目为奇数的AHL信号分子，即c7-HSL。

2.2 维氏气单胞菌生长过程中AHLs活性变化

细菌产生的AHLS分子浓度受细菌密度变化影响，不同生长阶段的细菌AHLS提取液能诱导根癌农杆菌产生不同直径的蓝色圈。维氏气单胞菌生长过程中的细菌总数与培养液PH值的变化见图3，AHLS活性变化见图4。分析可知，细菌培养4h时处于对数生长期初期，此时细菌分泌的AHLS可诱导根癌农杆菌显蓝色。在4～10h细菌的快速生长阶段，根癌农杆菌的变色直径不断增大，说明AHLS的含量快速累积。在10～18h时，根癌农杆菌蓝色圈的直径最大，此时培养液中AHLS浓度最高。在18～48h，细菌处于生长稳定期，诱导报告菌变色的直径减小，说明AHLS的浓度开始降低。研究发现，AHLS含量的减少与环境PH值升高有关。AHLS的高丝氨酸内酯环在碱性条件下结构不稳定，易解环。对细菌生长过程中培养液的PH值变化的分析表明：细菌培养18h后培养液的PH值由6.92增至8.11，培养48h时PH值达8.97。随着细菌的生长，培养液的PH值不断升高，AHLS开始降解，活性降低。

2.3 维氏气单胞菌的基因分析

革兰氏阴性菌AHLS介导的群体感应系统主要由luxRI的同源基因调控。利用PcR技术分析维氏气单胞菌中的luxRI同源基因，结果见图5a。分析发现2个片段序列分别为转录调控因子AcuR和自诱导基因AcuI，这与ＪangId等的研究结果相同，该学者首次在维氏气单胞菌mTcc3249中检测到AcuRI群体感应系统。此外，分析维氏气单胞菌的氨基酸脱羧酶基因和毒力基因，结果见图5b、5c。鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）和赖氨酸脱羧酶基因（LDC）的检出说明该细菌具有产腐胺和尸胺的能力，胞外酶基因（AhyB，ser，liP）的检出说明该菌具有一定的蛋白酶活性和脂肪酶活性，鞭毛基因（flA）的检出说明该菌具有鞭毛运动和形成生物膜的能力。

2.4 大蒜提取物对维氏气单胞菌产AHLs的抑制作用

大蒜提取物对维氏气单胞菌的最小抑菌质量浓度为2.5mg/mL（数据未显示）。本试验选择低于此质量浓度的系列（0，0.15，0.3，0.6，1.2mg/mL）来研究大蒜提取物对维氏气单胞菌群体感应的干扰作用。

通过检测生物报告菌根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性来分析不同浓度大蒜提取物对维氏气单胞菌产生AHLS活性的干扰作用，结果见图6。分析可知，随着大蒜提取物质量浓度的增加（0～1.20mg/mL），根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性不断降低（P＜0.05）。这说明大蒜提取物对维氏气单胞菌产AHLS活性具有显著的抑制作用（P＜0.05），且大蒜提取物的质量浓度与其群体感应抑制活性呈明显量效关系。大蒜提取物质量浓度为1.20mg/mL时对根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性的抑制率最高，为39.6%。这可能是因为此质量浓度下维氏气单胞菌AcuR蛋白与群体感应抑制活性物质的结合力最强，抑制了AHLS分子的转录表达。

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