醇脱氢酶催化合成(S)
大量的醇脱催化天然和非天然生物活性物质分子中具有一个或多个哌啶环,包括许多市售的氢酶活性药物成分。手性哌啶醇及其衍生物是合成制药工业中重要的中间体,比如(S)-N-Boc-3-羟基哌啶(S)-NBHP)是醇脱催化合成依鲁替尼药物的关键手性中间体,其市售品名为Imbmvica,氢酶是合成一种靶向B细胞的抗癌药物。依鲁替尼已于2013年获得美国食品和药物管理局的醇脱催化批准用于治疗套细胞淋巴瘤,分别于2014年和2015年获得批准用于治疗慢性淋巴细胞性白血病和淋巴浆细胞性淋巴瘤。氢酶目前手性哌啶醇主要是合成通过化学方法将原料通过多步转化制备而得.产率和产品纯度不理想同。最近,醇脱催化酮还原酶(KRED)催化N-Boc-3-哌啶酮(NBPO)的氢酶不对称还原反应在手性哌啶醇的合成中显示出良好的性能。2014年通过商业KRED实现100g/LNBPO的合成生物转化,首开醇脱氢酶合成(S)-NBHP的醇脱催化先河。然而,氢酶本篇研究中所采用的合成KRED及其后报道的醇脱氢酶均具有一定程度的底物抑制和产物抑制,且反应需要添加昂贵的辅酶,不利于高浓度条件下实现酶法规模化制备(S)-NBHP。因此,筛选具有良好催化性能的醇脱氢酶(或酮还原酶)对实现高效酶法制备(S)-NBHP具有重要意义。 作者对本实验室保存的还原酶库进行了筛选,旨在获得对NBP0具有优良催化性能的还原酶。该酶库中的还原酶具有20%~50%的氨基酸序列同源性,并能够催化还原多种酮类物质。研究发现,来源Kluyveromycespolyspora的醇脱氢酶KpADH显示出较大的潜力,适用于酶法不对称合成(S)-NBHP。基于对不同反应体系的研究,解释了产物抑制的主要因素,并通过不添加任何助溶剂的单水相体系解除了产物抑制的影响,实现了无需额外添加辅酶NADPH的条件下(S)-NBHP的高效和绿色合成。 辅酶NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、NADP+(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NAD+(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)等:购于深圳邦泰生物科技有限公司;质粒DNA抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、β-巯基乙醇、TEMED、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素(Kan)等:购于上海捷瑞生物工程有限公司:N-Boc-3-羟基哌啶:购于上海麦克林生物公司:N-Boc-3-哌啶酮:购于上海皓伯化工有限公司。 所有质粒均保存于江南大学生物工程学院生物催化与酶工程实验室还原酶文库,并在Escherichia.coliBL21(DE3)中表达。 以NBP0作为底物,在30℃下测定340nm处NAD(P)H吸光度的变化,计算比活力。200μL活力测定体系包括:10μL粗酶液(适当稀释倍数),10μLNBPO(溶于乙醇,终浓度为5mmol/L),10μLNAD(P)H(终浓度为1mmol/L)和170μL磷酸缓冲液(100mmol/L,pH7.0)。一个酶活力单位(U)定义为在上述条件下每分钟氧化1μmolNAD(P)H所需的酶量。 反应液用乙酸乙酯萃取,无水硫酸钠干燥,并通过真空蒸发器挥发乙酸乙酯。采用高效液相色谱法(HPLC)分析立体选择性及转化率。立体选择性分析采用SuperchiralS-AY柱(4.6mm×150mm,ShanghiraiChiralwayBiotechCo.Ltd)测定,流动相为体积分数95%的正己烷和体积分数5%的乙醇。转化率分析使用C18柱(4.6mm×250mm,Diamonsil,ShanghaiDIKMACo.Ltd),流动相为体积分数55%的乙腈和体积分数45%的水。检测器波长均为210nm,柱温为30℃。 将含有KpADH重组质粒的大肠杆菌接种到LB培养基中,并加入50μg/mL的卡那霉素(Kan),在37℃和180r/min下振荡培养。当OD600达到0.8时,加入异丙基书-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG,0.2mol/L)至终浓度0.2mmol/L。并将温度降低至25℃诱导蛋白质表达。培养结束,通过离心收集细胞并在PBS缓冲液(pH7.4)中进行超声破碎。将细胞裂解液以8000r/min离心30min。最后,通过亲和色谱法纯化细胞裂解液,并通过SDS-PAGE分析。 将KpADH的纯酶液稀释至1mg/mL左右,取稀释的酶液1mL放入30℃恒温水浴锅中保温。定时取样并采用上述1.3的测活方法。以Oh的活力为100%,依次测定比活力随时间变化的曲线,活力下降到50%的时间为该蛋白质在30℃的半衰期。 采用纯酶液测定硒ADH的动力学参数,使用上述1.3的测活方法,测定不同浓度底物(0.5~50mmol/L)和产物(0~100mmol/L)的比活力,使用0rigin软件分别进行非线性回归拟合。拟合方程包括:米氏方程、竞争性抑制方程、非竞争性抑制方程、反竞争性抑制方程、混合性抑制方程;并获得参数抑制常数Ki、米氏常数Km、最大反应速率Vmax,采用0rigin评估拟合结果并通过MatLab软件作图。以上所有数据均独立测定3次。 反应在20mL的磁力搅拌夹套反应器中进行,将1g底物、1.2g葡萄糖、20mg葡萄糖脱氢酶冻干酶粉、35mgKpADH冻干酶粉及不同助溶剂分别加入10mL反应体系中,30℃恒温条件下反应,并采用自动滴定仪滴定1mol/LNa2CO3,使pH维持在7.0。反应进程中定点取样,通过液相色谱分析获得转化率及终产物的对映体过量值(e.e.值)。 准确配制lmol/L的NBP0及NBHP,取20μL加入480μL缓冲液中,再按照体积比1:1加入有机溶剂,吸取200μL水相,加入400μL乙酸乙酯萃取并烘干,通过液相色谱分别计算出底物及产物的浓度。分配系数等于底物NBP0和产物NBHP分别在有机相和水相浓度的分配比。每个样品分别做3个平行。 将纯化的KpADH酶液(保持蛋白质质量浓度在1mg/mL左右)与有机溶剂按体积比1:1混合,在30℃和1000r/min条件下振荡并保温12h,吸取水相中的酶液采用1.3的测活方法,进行残余活力的测定。 反应在20mL的磁力搅拌夹套反应器中进行,将2g底物、2.4g葡萄糖、40mg葡萄糖脱氢酶冻干酶粉、70mg脚ADH冻干酶粉分别加入10mL反应体系中,30℃恒温反应,并采用自动滴定仪滴定lmol/LNa2C03,使pH维持在7.0。反应结束后,采用二氯甲烷将反应液萃取3次,收集萃取后的二氯甲烷,并通过旋转蒸发仪挥发二氯甲烷,获得产品(S)-NBHP。采用HPLC分析产品的立体选择性。 声明:本文所用图片、文字来源《食品与生物技术学报》,版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系 相关链接:乙酸乙酯,卡那霉素,异丙基书-β-硫代半乳糖吡喃糖苷1 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 菌株
1.3 高通量活力测定方法
1.4 分析方法
1.5 蛋白质的表达及纯化
1.6 半衰期的测定
1.7 产物抑制动力学测定
1.8 酶促不对称合成反应的条件优化
1.9 底物及产物分配系数的测定
1.10 有机溶剂耐受性的测定
1.11 克级制备(S)-NBHP
- 最近发表
-
- 大降价倒计时 备货仅剩16天
- 日本商店街如何成為當地區民的生活綠洲?造就其成功的三大商業要素
- 金正恩強迫所有與女兒「金朱愛」撞名的女性改名,還將女兒印在郵票上
- 【專訪】《活得像個穿制服的人》作者王惀宇:派出所警察是面對人民的第一線,也是官僚體系裡退無可退的受害者
- 货不对板、质疑被踢、差评不显、维权无门——百花日记买花后,我被踢出了花友群
- 阿蘭柯爾本《時間、欲望與恐懼》:女傭之考古學, 與資產階級之遐想
- 南北分裂之十六國尾聲(中):苻堅敗戰淝水之後,慕容氏建立起十年短暫榮光
- 從財務比較分析看出影響PChome、momo購物網獲利差異的「貓膩」
- “人脸识别第一案”:只是看个动物 为啥强制刷脸
- 北京交通銀行將房貸還款上限延長到95歲,網友譏「債留子孫」、「貸貸相傳」
- 随机阅读
-
- 我市节能降碳和淘汰落后产能获省考核组高度评价
- 潔西卡.雀絲坦重返百老匯出演易卜生經典劇作《玩偶之家》
- 行銷科技須知:是否覺得CDP跟傳統的CRM、DMP功能有些類似?這三個工具有何差別?
- 網傳做愛時「老婆先高潮必生男」,這樣的說法有依據嗎?可不可信?
- AI陪练篮球机器人:既是“教练”又当“玩伴”
- 歐洲特產「酸沼木乃伊」:屍體臉部細紋、神情清晰可見,生前可能遭活人獻祭、謀殺或處刑
- 台達電董事長海英俊:電動車爆發時機已到,子公司泰達電走向「區域製造」大搶訂單
- 《用說話改變人設的「最高口才訓練法」》:提高口才能力,你就能擁抱全世界。真的是這樣嗎?
- 公益集市进社区 志愿服务暖人心_
- 美國團隊研發比天然木材更堅固的人造木,還能有效吸收大氣中的二氧化碳
- 《給自己一個擁抱,給希望一點時間》:時間證明,憂鬱症替我想像出來的那些事都是謬論
- 【藝遊嚮導】2/14
- “可以打到地球任何一个角落”,俄成功试射新型洲际弹道导弹
- 外資:鴻海未來2至3年中國以外產能比重升至3成,2025年在全球電動車市占率達到5%
- 世界各地「長壽藍區」百歲人瑞都怎麼吃?換算下來每餐花費只需台幣60元
- 英超球星孫興慜遭受種族歧視言論攻擊,熱刺隊譴責並呼籲社群平台與當局採取行動
- 打击侵权假冒在行动|福建泉州上半年立案612起
- 最大訴求是「返工」?德國國防意識
- 公視紀實第三季《勳章》、《獨弦之歌》:透過癌症與南管,看見女性的堅韌與柔情
- 印度阿薩姆省掃蕩童婚,百餘名婦女不領情到警局前示威,另有數人輕生
- 搜索
-
- 友情链接
-