肉桂醛缩氨基脲对黄嘌呤氧化酶的抑制作用研究（一）

黄嘌呤氧化酶是肉桂体内尿酸生成的关键酶，它能催化次黄嘌呤和黄嘌呤转化为尿酸。醛缩尿酸过多可导致痛风。氨基全球痛风发病率与日俱增，脲对并呈年轻化趋势，黄嘌化酶成为第二大威胁人类生命和健康的呤氧代谢性疾病，因此研发防治痛风、制作高尿酸血症的用研药物成为目前医药界的一个研究热点。XOD抑制剂可减少体内尿酸生成，肉桂预防痛风病。醛缩肉桂醛又称桂皮醛，氨基是脲对斯里兰卡肉桂油、桂皮油、黄嘌化酶藿香油、呤氧风信子油和玫瑰油等精油的制作重要活性成分。肉桂醛具有杀菌消毒、抗溃疡、抗病毒、抗癌等功能。有研究报道了肉桂挥发油和肉桂醛的体内降尿酸和血清XOD抑制实验，结果显示肉桂挥发油和肉桂醛具有较好的体内降尿酸活性，肉桂醛体外实验有XOD抑制活性。但活性比阳性药别嘌醇稍弱。另外，Maria等研究表明缩氨基脲类席夫碱类物质有较强的XOD抑制作用。基于肉桂醛与席夫碱均能抑制XOD，本研究采取基团拼合原理，合成肉桂醛缩氨基脲及缩氨基硫脲类席夫碱，并测定其对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。探讨其构效关系，旨在筛选出高效低毒的黄嘌呤氧化酶的抑制剂。

1 材料与方法

1.1 实验材料

氧嗪酸钾盐、尿酸、黄嘌呤、别嘌呤醇、黄嘌呤氧化酶：均购自美国Sigma-A1drich公司；肉桂醛、4-甲基氨基硫脲、4-苯基氨基硫脲、氨基脲、氨基硫脲、Na₂HP0₄·12H₂0、NaH₂P0₄·2H₂0、氢氧化钠、EDTA、DMSO：均购自上海国药厂，分析纯；尿酸测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所，生产批号20180530；XOD测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所，生产批号20180720。

1.2 实验仪器

UV-2450紫外分光光度计：购自日本岛津公司；集热式恒温加热磁力搅拌器、精密电子天平BT25S：购自美国热电尼高力公司；旋转蒸发器RE52CS-1：购自上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ：购自郑州长城科工贸有限公司；红外光谱仪FTIRNicolet5700、高分辨率四级杆-飞行时间质谱仪Agilent6538、核磁共振仪AV-600：均购自德国Bmker公司。

1.3 实验动物

健康雄性昆明种小鼠40只，体质量18～22g：由江西中医药大学实验动物科技中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(赣)2018-003。实验前饲养一周，以适应环境。饲养条件：室温(25±2)℃，相对湿度60％-70％。

1.4 实验方法

1.4.1 肉桂醛衍生物的合成

成将10mmol氨基脲或氨基硫脲类物质加入100mL三颈烧瓶中，准确加入15mL无水乙醇，加热磁力搅拌器中恒温70℃回流10min溶解，然后逐滴滴加10mmol的肉桂醛，溶液逐渐变为黄绿色，加4滴冰乙酸，回流4h后发现有固体析出，冷却至室温后过滤，重结晶，即可得到产物。其中化合物a是肉桂醛缩氨基脲，cinnamicaldehydesemicarbazone，CAS；化合物b是肉桂醛缩氨基硫脲，einnamaldehvdethiosemi-carbazide，CT；化合物c是肉桂醛缩甲基氨基硫脲，cinnamaldehvdeshrinkagemethylthiosemica曲azide，CSMT；化合物d是肉桂醛缩4-苯基氨基硫脲，cinnamaldehvdeshrinkagemethylthiosemicarbazide，CSMT(图1)。
 

1.4.2 合成化合物的结构表征

通过UV、IR、¹H-NMR、ESI-MS进行结构表征。

UV光谱：将肉桂醛衍生物分别溶于无水乙醇.配成浓度为1×10^-5m01/L的溶液，测定紫外-可见吸收光谱，测定波长为200-600nm。

IR光谱：将肉桂醛衍生物1mg和100mgKBr充分研磨后压片，在400～4000cm^-1范围内，扫描32次，分辨率为4cm^-1，测定肉桂醛衍生物的红外吸收光谱。

¹H-NMR：样品10mg加入0.5mL氘代溶剂溶解。25℃条件下，配备5mmPABB0探针，在BrukerDRX400MHz波谱仪上进行测定。使用MestReNova软件处理数据。参数选择后采样、傅立叶变换、调相位、校正零点、积分、定最大最小值、打印图谱等步骤进行氢谱的测量。

ESI-MS质谱条件：ESI电喷雾离子源，负离子检测，离子源温度120℃。雾化器压力206850Pa，干燥气氮气流量7L/min，温度350℃。毛细管电压25kV，锥孔电压20V，锥孔气流量50L/h，检测电压l600V。用MassLvnx软件处理数据。

1.4.3 化合物对XOD酶抑制机理

1)酶活性测定

黄嘌呤氧化酶的作用下，黄嘌呤被氧化生成尿酸。实验方法参照Cos等的方法并略有修改。各化合物分别用DMSO溶解，制备样品液。黄嘌呤氧化酶水溶液(0.2U/mL)用超纯水配制，浓度为0.15mmol/L的黄嘌呤底物溶液用PBS缓冲溶液配制(pH7.5)。总反应体系3mL，先加入PBS缓冲溶液0.85mL，0.15mmol/L的黄嘌呤底物溶液2mL，再加入0.05mL不同浓度的样品溶液，混匀1分钟。然后加入0.1mL黄嘌呤氧化酶水溶液，立即摇匀，25℃水浴，于290nm处测定酶促反应曲线，每隔10s测一次吸光值，持续200s。黄嘌呤氧化酶的活性相当于曲线线性期部分的斜率。以样品浓度作横坐标，相对酶活作纵坐标，作图得到黄嘌呤氧化酶活性抑制曲线。重复测定3次。抑制率为：

抑制率(％)=((S₀-S₁)/S₀)×100％

式中：S₀是无样品组别的斜率，S₁是添加样品组别的斜率。

2)肉桂醛缩氨基脲对XOD的抑制类型

以黄嘌呤为底物，研究肉桂醛缩氨基脲抑制黄嘌呤氧化酶活性的机理，即可逆抑制或者不可逆抑制。在测活体系中，固定底物黄嘌呤浓度，依次加入肉桂醛缩氨基脲浓度0、50、75、100μmo此，改变XOD酶的质量浓度，测定不同浓度的抑制剂肉桂醛缩氨基脲对XOD催化氧化黄嘌呤能力的影响。以酶促反应的速度对酶质量浓度作图，若得到一系列通过原点的直线，则为可逆抑制；若得到一组平行线，则为不可逆抑制。

3)肉桂醛缩氨基脲对XOD的抑制常

参照上述酶反应体系，以黄嘌呤为底物，研究肉桂醛缩氨基脲对黄嘌呤氧化酶活性的抑制常数。改变加入黄嘌呤的浓度，固定酶的浓度，测定不同浓度肉桂醛缩氨基脲(0、30、40、60μmol，L)抑制黄嘌呤氧化酶活性的效果。抑制类型由Lineweave-Burk双倒数作图法来判断。纵坐标是直线的斜率或Y轴的截距，横坐标是各化合物浓度，作图，可计算相应的抑制常数(K_I或K_IS)。

相关链接：肉桂醛，氨基脲，氢氧化钠，尿酸

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