细胞水平染料木素协同维生素D3的抗骨质疏松作用（一）

骨质疏松症是细胞协同一种常见的代谢性骨病。世界卫生组织在2015年提出的水平素D疏松《关于老龄化与健康的全球报告》指出，在国家和全球层面上需要重新和持续关注改善肌肉骨骼健康。染料骨重建过程取决于维持成骨细胞形成骨基质与破骨细胞消除骨矿化之间的木素平衡。成骨细胞响应骨细胞产生的维生信号，并将破骨细胞前体募集到重塑部位，骨质然后，作用通过骨保护素（OPG）/核因子κB配体受体激活剂（RANKL）/核因子κB受体激活剂（RANK）系统的细胞协同受体激活剂，成骨细胞可调节破骨细胞的水平素D疏松生成。

骨质疏松症主要是染料体内维生素D缺乏，钙摄入量不足以及雌激素下降引起的木素。目前，维生人们普遍接受雌激素替代疗法用于治疗因缺乏雌激素的骨质骨质疏松症患者。然而其有副作用，作用尤其是细胞协同增加乳腺癌的风险。维生素D3（VitaminD₃，VD₃）是骨形成系统中的重要参与者，在钙稳态中具有增加钙从肠道吸收的功能。饮食中摄入足够的维生素D3是必要的，其广泛存在于油性鱼和鳕鱼肝油中。染料木素（Genistein，Gen）是常见的异黄酮植物雌激素化合物之一，在大豆中的含量丰富，也是可食用的天然物质，能够有效降低副作用。

目前已有大量从细胞及动物水平上研究关于维生素D₃或者染料木素对骨质疏松症的影响。维生素D₃及染料木素在促进成骨细胞的分化过程中存在协同作用，协同诱导成骨细胞活化并阻止破骨细胞的分化。适当剂量的染料木素与钙和维生素D₃结合被视为预防和管理骨质流失的一种新的潜在疗法。

本文在细胞水平上验证维生素D₃和染料木素对治疗骨质疏松症的协同作用，并研究维生素D₃和染料木素在破骨细胞形成中的作用，为通过维生素D₃治疗骨质疏松症提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠巨噬细胞RAW264.7、人成骨肉瘤细胞MG-63，均购自中国科学院上海细胞库。

DMEM培养基（无酚红）、Trizol试剂、胰蛋白酶，上海生工生物有限公司；Western及IP细胞裂解液，碧云天生物技术；染料木素、维生素D₃，维克奇生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO），美国Sigma-Aldrich公司；抗坏血酸、茜素红S染色液（1%，pH4.2）、西吡氯铵（CPC）、β-甘油磷酸钠，北京索莱宝科技有限公司；核因子κB受体活化因子（RANKL），美国ROCKLAND公司；胎牛血清（FBS），NQBB；抗酒石酸酸性磷酸酶染液、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒，南京建成生物工程研究所；噻唑蓝（MTT）、琼脂糖，美国Invitrogen有限公司。

1.2 仪器与设备

全自动凝胶成像系统，英国Syngene公司；IX71荧光显微镜，日本Olympus公司；Flash全波长扫描荧光酶标仪、7500RealTimePCRSys-tem，美国赛默飞公司；垂直层流洁净工作台，上海净化设备有限公司；Heracell150二氧化碳培养箱、BiofugeStratos冷冻离心机，美国赛默飞公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养

人成骨肉瘤细胞MG-63和小鼠巨噬细胞RAW264.7均在5%CO₂、37℃细胞培养箱中培养，培养基使用含10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（青霉素和链霉素）的无酚红DMEM培养基。

1.3.2 MTT法测定细胞增殖

取生长状态良好的对数生长期人成骨肉瘤细胞MG-63或者小鼠巨噬细胞RAW264.7，以每孔5×10³个接种于96孔板中。待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的染料木素、维生素D₃，对照组加入等体积的培养基。药物作用一定时间后吸除96孔板中的培养基，在37℃环境下，每孔用100μLMTT溶液（0.5mg/mL）孵育4h。小心吸除孵育后的MTT溶液，每孔用100μLDMSO溶解紫色结晶甲瓒，轻柔混匀。使用酶标仪以630nm波长处的A值作为参照，检测570nm波长处的吸光度A值。

1.3.3 碱性磷酸酶（ALP）活性测定

人成骨肉瘤细胞MG-63以每孔2×10⁵个接种于6孔板，待细胞贴壁后，给药组添加不同浓度的药物，对照组加入等体积的培养基培养一定时间。检测时用PBS洗2遍，每孔加入150μL的细胞裂解液裂解细胞，置冰上30min后，4℃下离心15min，转速为14000r/min，吸取上清液置于冰上，测定ALP活性严格按照ALP试剂盒说明书操作，检测波长520nm。

1.3.4 茜素红染色鉴定骨矿化

人成骨肉瘤细胞MG-63以每孔2×10⁵个接种于6孔板，待细胞贴壁后，矿化组和给药组均换用含50μmol/L抗坏血酸和10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的DMEM培养基培养，给药操作同1.3.3节。每天观察细胞状态，每1～2d更换培养基1次。21d后在倒置显微镜下观察，部分细胞成片积累生长，出现形状各异的“黑斑”，即为矿化结节。PBS清洗细胞2遍晾干，95%乙醇固定10min，蒸馏水清洗后晾干。加入茜素红S染色液（1%，pH4.2），37℃染色60min。蒸馏水清洗2～3遍将未结合的染料洗掉，动作轻柔避免洗掉细胞，晾干后倒置显微镜下拍照并记录。每孔加1mL10%CPC溶液充分溶解深红色化合物，测定其在550nm下A值，钙结节的量与A值的大小成正比，以定量钙沉积情况。

1.3.5 诱导破骨细胞

小鼠巨噬细胞RAW264.7，以1×10⁴/孔接种于24孔板，待细胞贴壁后，加入含50ng/mLRANKL诱导剂的培养基诱导破骨细胞生成。诱导6d后在倒置显微镜下可观察到有多核细胞的形成，根据抗酒石酸酸性磷酸酶染液说明进行染色，倒置显微镜下观察拍照。记录到含有大于3个细胞核的TRAP阳性多核细胞为破骨细胞。

1.3.6 破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性检测

小鼠巨噬细胞RAW264.7以每孔5×10³个接种于6孔板中，每孔2.5mL。细胞贴壁后，给药组和对照组均用含RANKL诱导剂（50ng/mL）的培养基培养细胞，给药组加入不同浓度的不同药物。每1～2d更换培养基1次，培养6d。处理结束后，收集细胞，PBS洗1～2遍，每孔加入150μL的细胞裂解液裂解细胞，置冰上30min后，在4℃下离心15min，转速为14000r/min，取上清液为总蛋白置于冰上，测定TRAP活性严格按照TRAP试剂盒说明书操作，检测波长530nm。

1.3.7 人成骨肉瘤细胞MG-63的RNA提取及RT-PCR

MG-63细胞以每孔1×10⁵个接种于6cm培养板，细胞贴壁后加入药物（分组及给药情况同1.3.3节）。培养24h后收集细胞。用Trizol提取总RNA进行RT-PCR扩增。PCR扩增反应条件：采用两步PCR反应程序法，第一步预变性95℃、30s；第二步PCR反应，95℃、5s，60℃、34s，循环40次。目的基因mRNA水平以与参照基因GAPDH的Tm比值表示。PCR引物序列如表1所示。

1.3.8 破骨细胞的RNA提取及RT-PCR参照1.3.6节方法处理细胞

细胞提取RNA及RT-PCR方法同1.3.7节。

1.3.9 试验数据处理及统计分析

所得数据为x-±s表示，n≥3，使用邓肯字母标记法标记多重比较，采用SPSS19.0统计软件进行方差的T检验分析。P＜0.05差异具有显著统计学意义。

相关链接：二甲基亚砜，胰蛋白酶，抗坏血酸，西吡氯铵

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