UPLC/MS/MS法测定饮料中甜蜜素、糖精钠和安赛蜜（二）

③含乳的法测饮料

准确取2～5g（精确至0.0001g）样品，加入1.0mL亚铁氰化钾溶液和1.0mL乙酸锌溶液，定饮摇匀，料中加水定容至10mL，甜蜜涡旋混匀，素糖赛蜜5000r/min离心5min，精钠取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，和安备用。法测

（2）标准曲线的定饮制作

将标准系列溶液经0.22μm微孔滤膜过滤，分别注入液相色谱-串联质谱仪中，料中测定相应的甜蜜峰面积，以标准工作液的素糖赛蜜浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，精钠绘制标准曲线。和安

③试样溶液的法测测定

将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，以保留时间定性，同时记录峰面积，根据标准曲线得到待测液中3种添加剂的浓度。

定性判断：试样中目标化合物色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时间一致，变化范围应在（±2.5%）之内。待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应≥3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应≥10（S/N≥10）。

目标化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子（甜蜜素为一个母离子和一个子离子），且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过规定的范围。

式中：x——样品中待测组分的含量（μg/kg）；

C——测定液中待测组分的浓度（μg/L）；

C₀——空白中待测组分的浓度（μg/L）；

V——定容体积（mL）；

M——样品称样量（g）。

二、结果与讨论

1、流动相选择

实验中考察选用0.05%氨水-甲醇、5mmol/L乙酸铵-甲醇、10mmol/L乙酸铵-甲醇作流动相，实验表明0.05%氨水-甲醇作为流动相三种目标物响应最高，10mmol/L乙酸铵-甲醇作流动相三种目标物响应最低。图2为1.0mg/L混合标准溶液在不同流动相中的响应值。文献报道中流动相选用盐溶液，如10mmol/L乙酸铵、甲酸铵-乙腈，本文所用仪器为WatersAcquityUPLC-XEVOTQD，若使用10mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相，在仪器Intellistart功能中并不能找到目标化合物的MRM，手动优化发现目标化合物MRM响应很低。若使用5mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相Intellistart功能中并可以找到目标化合物的MRM，但与使用0.05%氨水-甲醇作为流动相相比，离子响应较低，XEVOTQD在负离子模式下，碱性环境更有利于化合物去氢生成负离子，因而文中选用0.05%氨水-甲醇作为流动相。

2、含乳饮料样品前处理的优化

样品不经净化处理，基质抑制效应明显，因此实验中考察用三氯乙酸溶液（1g/L）、PSA分散固相萃取、乙酸锌-亚铁氰化钾净化样品。三氯乙酸溶液是很好的蛋白沉淀剂，但三氯乙酸吸电子效应明显，不利于三种目标化合物脱氢电离。PSA固相吸附剂，与NH2相似的吸附剂，有两个氨基，比氨基柱更强的离子交换能力，弱阴离子交换（水溶性基质），用于去除有机酸、色素和金属离子。用PSA分散固相萃取可以很好的去除饮料中的去除有机酸、色素和金属离子，但它同时也会吸附部分糖精钠和安赛蜜（见图3），因而一般样品经过滤后直接测定糖精钠与安赛蜜含量，经PSA分散固相萃取后过滤测定甜蜜素含量，0.3～0.5gPSA用量可以得到较好的回收率。

2Zn²⁺+［Fe（CN）6］⁴⁺=Zn₂［Fe（CN）6］↓（白色），乙酸锌与亚铁氰化钾反应生成的氰亚铁酸锌沉淀来挟走或吸附干扰物质，这种澄清剂除蛋白质能力强，但脱色能力差。实验中考察沉淀剂的用量：分别用乙酸锌-亚铁氰化钾0.5～0.5mL、0.75～0.75mL、1.0～1.0mL、2.0～2.0mL、1.0～2.0mL（物质量之比1∶2）和2.0～1.0mL（物质量之比4∶1）处理5.0g样品，实验表明只有当氰亚铁酸锌含量达到0.00075moL时，且按照化学计量反应比例加入沉淀剂，三种化合物的回收率才较好（见图4），但过多的盐溶液进入UPLC/MS/MS系统会在锥空上沉积，影响电离效率，因而本实验选用沉淀剂用量为：乙酸锌0.0002moL，亚铁氰化钾0.0001moL。对其他含乳样品可以参考本实验选择合适的沉淀剂用量。

3、方法线性方程、检出限和定量限

3种化合物工作标准曲线见表3，安赛蜜和甜蜜素在5～200μg/L范围内，糖精在20～200μg/L范围内，线性相关系数r＞0.995，20μg/L和200μg/L标准溶液连续进样6次，精密度为8.6%和5.4%，方法检出限（S/N=3）为0.2～10μg/kg，方法定量限（S/N=10）为0.6～30μg/kg，见表3。

4、样品加标回收实验

3种化合物在自制奶茶中三个级别添加量的回收率为78.9%～95.7%，在某品牌果茶中三个级别添加量的回收率为80%～102%，回收良好。见表4。

5、样品检测结果

测定5份定型包装饮料与5份自制奶茶均未检出3种添加剂。

三、结论

本文建立UPLC/MS/MS法测定饮料品中的甜蜜素、糖精钠和安赛蜜的检测方法，即一般样品经过滤处理，检测样品中的糖精和安赛蜜的含量；经PSA分散式固相萃取后，检测样品中甜蜜素含量；含乳样品经乙酸锌-亚铁氰化钾去蛋白处理；用0.05%氨水-甲醇做流动相，负离子模式采集。与其他分析方法相比，操作简单，检出限低，重现性好，回收率良好，干扰小，避免甜蜜素衍生反应，消除样品基体抑制效应，适用于饮料样品中3种添加剂的测定。

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