响应面法优化川芎蛋白提取工艺及抗氧化活性研究（一）

川芎为伞形科植物川芎的面法干燥根茎，性味辛温，优化氧化研究归肝、川芎胆、蛋白心包经，工艺具活血行气、及抗祛风止痛的活性功效。首载于《神农本草经》，面法为著名的优化氧化研究川产道地药材。目前对川芎所含成分的川芎研究，主要集中于小分子成分，蛋白对川芎大分子成分的工艺研究甚少。前期研究初步表明，及抗川芎中含有丰富的活性蛋白质，且具有较好的面法抗氧化能力。天然蛋白质因其来源丰富、可生物降解、环境友好性和高生物活性等特点，近年来成为天然抗氧化剂的研究热点。

氧自由基对生物大分子、氨基酸、DNA、脂类和蛋白质等造成氧化损伤且与癌症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、神经功能障碍和免疫系统减弱等慢性疾病的发生有关。经研究发现，植物源蛋白质具有抗凝血、抗肿瘤、抗氧化和抗真菌等生物活性，如石斛蛋白提取液、葛根蛋白、豌豆蛋白、黑豆蛋白等均具有较好的抗氧化活性，对羟基自由基和DPPH自由基有良好的清除效果，大豆蛋白具有较强的DPPH自由基清除能力。目前，川芎蛋白（LCP）抗氧化能力的相关研究未见报道，本研究旨在通过Box-Behnken响应面法确定其最佳提取条件；以DPPH自由基清除、羟自由基清除和超氧阴离子自由基清除率为指标，以抗坏血酸为阳性对照进行分析，考察LCP的抗氧化活性，同时为LCP的开发提供可靠的数据资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

川芎，贵阳济仁堂药业有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、考马斯亮蓝R250、十二烷基硫酸钠、Maker、抗坏血酸标准品（VC）北京索莱宝科技有限公司；DPPH自由基清除能力试剂盒、羟自由基清除能力试剂盒、超氧阴离子清除能力试剂盒　苏州格锐思生物科技有限公司。

PHS-3CpH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；AL204电子天平，美国梅特勒托利多公司；FD冷冻干燥机，上海拓纷机械设备有限公司；MultiskanFC酶标仪，赛默飞（上海）世尔仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白浓度测定

分别吸取5mg/mL的标准溶液4、6、8、10、12、14、16、18、20μL于96孔板中，并用蒸馏水补足至20μL。分别加入200μLBCA工作液（BCA试剂与铜试液50:1）混匀，室温静置l0min，于650nm下检测不同浓度牛血清蛋白溶液的吸光值A，以蛋白质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：y=2.2706x+0.0402（R2=0.9993）。川芎提取物中LCP浓度根据上述回归方程求得。

1.2.2 单因素实验

基于前期研究，以LCP得率为检测指标，分别以pH、提取时间、料液比为影响因素以设计单因素实验。

1.2.2.1 川芎药材前处理

取干燥洁净的川芎药材，粉碎，过3号筛（50目）。称取适量过筛后的川芎药材粉末置于圆底烧瓶中，加4倍量沸程为30～60℃石油醚水浴回流脱脂1h，静置后过滤，将川芎药材粉末于通风橱自然晾干，备用。

1.2.2.2 LCP的提取

精密称取川芎药材粉末3g，平行三份，加入Tris-HCl（68mmol/L，0.5%SDS，5%甘油，10%β-巯基乙醇）溶液，置于4℃冰箱浸提1.5h。5000r/min离心10min，收集上清，加入3倍量10%TCA-丙酮，置−20℃冰箱沉淀1.5h，5000r/min离心10min，收集沉淀，分别用丙酮及80%丙酮洗涤3次，5000r/min离心10min，收集沉淀，冷冻干燥即得LCP，按公式（1）计算得率。

式中：M₁表示川芎蛋白冻干粉的质量，g；M₂表示川芎药材的质量，g。

1.2.2.3 不同pH对LCP得率的影响

按“1.2.2.2”项下操作，固定提取时间为1.5h，料液比为1:15g/mL，研究提取液pH（3、4、5、6、7、8、9）对LCP得率的影响。

1.2.2.3 不同pH对LCP得率的影响

按“1.2.2.2”项下操作，固定提取时间为1.5h，料液比为1:15g/mL，研究提取液pH（3、4、5、6、7、8、9）对LCP得率的影响。

1.2.2.4 料液比对LCP得率的影响

按“1.2.2.2”项下操作，固定提取时间为1.5h，提取液pH为6，研究料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30g/mL）对LCP得率的影响。

1.2.2.5 提取时间对LCP得率的影响

按“1.2.2.2”项下操作，固定料液比为1:20g/mL，提取液pH为6，研究提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5h）对LCP得率的影响。

1.2.3 LCP提取条件的响应面试验设计

为选择最佳实验条件，以A（提取时间h）、B（料液比g/mL）、C（提取溶剂pH）为独立变量，蛋白得率为响应变量，采用DesignExport8.0.6的Box-Behnken响应面方法（RSM）优化过程。各组平行3次，因素和水平见表1。

1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳

采用贺小燕等试验方法，以4.5%的浓缩胶和12.5%的分离凝胶进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压80V电泳20min，分离胶电泳120V电泳80min，指示剂到达分离胶底部约1cm处停止电泳，考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色至条带清晰。

1.2.5 LCP等电点测定

取10支洁净离心管，称重。根据表2，分别加入不同体积LCP溶液（50mg/mL），再分别加入不同浓度、不同体积的乙酸溶液或去离子水，混合，测定pH。于4℃静置1h后，5000r/min离心15min。完全除去上清液后，将带有沉淀物的离心管称重，通过减重法计算沉淀质量。由于蛋白质在pI处沉淀最多，即可测定川芎的pI。

1.2.6 LCP溶解度的测定

将50mg样品悬浮在10mL蒸馏水中，并使用1mol/mL的HCl或NaOH溶液将悬浮液的pH调节至2～12。将悬浮液在22℃下连续搅拌1h，并在5000r/min离心15min，BCA试剂盒测定上清液中蛋白质的量。溶解度按公式（2）计算。

式中：M₁：悬浮液中加入的蛋白总量，mg，M₂：离心后上清液蛋白的量，mg。

1.2.7 LCP抗氧化能力的测定

1.2.7.1 羟自由基清除能力的测定

取不同浓度的LCP溶液各0.125mL，按试剂盒加入反应试剂一、试剂二、试剂三各0.125mL和0.5mL的蒸馏水，混匀，即为测定组。取等体积蒸馏水，依法制备空白组。取不同浓度的LCP溶液液各0.125mL，加入反应试剂一、试剂二各0.125mL和0.625mL的蒸馏水，混匀，即为对照组。于37℃反应20min，转移至玻璃比色皿中，蒸馏水调零，510nm读取各组吸光度值A，平行测定3次，以VC为阳性对照组，公式（3）计算清除率。

式中：A₁：空白组吸光度值，A₂：测定组吸光度值，A₃：对照组吸光度值。

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