高效液相色谱法测定黑果腺肋花楸提取物中氯化矢车菊素的含量及抗氧化性研究（二）

4、高效果腺体外抗氧化活性试验

（1）对DPPH的液相氧化清除能力

①DPPH溶液的配制自由基

精密称取19.716mgDPPH，用无水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，色谱素得C=0.2mmol／L的法测溶液，于40℃冰箱避光保存。定黑

②样品溶液的肋花制备

分别称取干燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢车菊素、楸提取物氯化矢车菊素、中氯VC适量，化矢含量溶解并且配制成不同质量浓度的车菊样品溶液。分别取不同质量浓度的及抗究样品溶液2mL于10mL比色管中，按参考文献所述方法进行操作，性研在517am处测定吸光度A_空白，高效果腺A_样品，液相氧化A_对照。色谱素按照公式计算黑果腺肋花楸提取物、矢车菊素、氯化矢车菊素、VC对DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率／％=(A_空白一A_样品+A_对照)／A_空白×100

式中，A_空白-蒸馏水代替供试品溶液与DPPH溶液反应后的吸光度值；A_样品-各供试品溶液与DPPH溶液反应后的吸光度值；A_对照-各供试品溶液与无水乙醇反应后的吸光度值。

（2）FRAP法测定总的抗氧化能力

①FRAP工作液的配制

分别配制0.2mol／L醋酸钠缓冲液(pH=3.6)，10mmol／LTPl亿溶液(溶于40mmol／L盐酸)，20mmol／LFeCl₃溶液。将上述三者按体积比10:1:1混合。

②FeSO₄标准曲线的制备

精确称取0.01419FeSO₄，溶解并定容至50mL容量瓶中，即得浓度为lmmol／LFeSO₄溶液。吸取该溶液适量，配制成质量浓度为2.82、8.46、14.10、19.74、25.38、28.20、33.84μg／mL的溶液。取各溶液加入3mLFRAP工作液，混匀后于37℃反应10min，于593nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定还原力标准曲线，列出拟合方程。

③被测物总抗氧化活性测定

分别称取干燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢车菊素、氯化矢车菊素、VC适量，溶解并且配制成不同质量浓度的样品溶液。分别取不同质量浓度的样品溶液3mL于10mL比色管中，按参考文献所述方法进行操作，在593nm处测定吸光度值。

(3)钼酸铵法测定总的抗氧化能力

①钼酸铵反应体系的配制分别称取

2.13g磷酸钠、0.99g钼酸铵、6.67mL硫酸溶于200mL水中，混匀。

②VC标准曲线的制备

精确称取0.02599VC，用蒸馏水溶解并定容至50mL容量瓶中，即得浓度为0.5mg／mL维生素C溶液。吸取该溶液适量，配制成质量浓度为25、50、75、100、200、250tg／mL的溶液。吸取O.5mL不同浓度的溶液，加入到5mL钼酸铵反应体系中，反应试管于95℃水浴90min。反应液充分冷却至室温后，于695am处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定VC抗氧化能力标准曲线，列出拟合方程。

③被测物总抗氧化活性测定分别称取干

燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢车菊素、氯化矢车菊素适量，溶解并且配制成不同质量浓度的样品溶液。分别取不同质量浓度的样品溶液0.5mL加入到5mL钼酸铵反应体系中，按参考文献所述方法进行操作，在695nm处测定吸光度值。被测物的总抗氧化能力以相当于多少浓度的VC来表示。

二、结果与分析

（1）色谱条件的选择

色谱柱为大连依利特ODS₂C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A为甲醇，B为0.2％磷酸水溶液(W)，程序为0～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱温：30℃；进样量：20μL；检测波长为276nm。氯化矢车菊素的保留时间为24.21min，理论塔板数为21917，与相邻峰的分离度为2.28。HPLC色谱图见图1。

2、流动相条件的选择

试验结果表明适宜的流动相为甲醇-O.2％磷酸水溶液(V:V=40:60)，能够将黑果腺肋花楸提取物中的氯化矢车菊素与其他物质分开，保留时间适中，按照氯化矢车菊素峰值计算理论塔板数为21917，与相邻峰的分离度为2.28，故选择在上述流动相条件下进行相关试验。

3、供试品溶液制备方法的优化试验结果

（1）正交试验结果

称取黑果腺肋花楸提取物9份，每份0.5g，放入圆底烧瓶中，按正交试验表进行试验，结果见表2。

正交试验结果表明：供试品溶液制备方法的最优方案为A₃B₃C₂，各因素的影响大小为：水解时间＞水解温度＞溶剂酸浓度，确定供试品溶液制备方法的最优方案为：水解温度为100℃、水解时间为120min、酸浓度为3％盐酸甲醇水溶液。

（2）工艺稳定性验证试验

三次试验结果氯化矢车菊素的峰面积分别为1379.85、1382.57、1380.43，平均值为1380.95，其氯化矢车菊素含量分别为1.8660、1.8527、1.8523mg／g，平均值为1.8570mg／g，RSD为0.78％，结果表明，优选的供试品溶液制备方法工艺比较稳定。

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