产共轭亚油酸菌株的筛选及其发酵性质研究（一）

天然的产共CLA主要存在于动物、植物、轭亚海产品中，油酸如在牛、菌株酵性究羊等反刍类动物的选及乳脂和肉制品中含量较高。c9，质研t11-CLA还被命名为瘤胃酸（ru-menicacid）。产共自上世纪50年代开始，轭亚人们接连在反刍动物的油酸脂肪组织、烤牛肉中发现了CLA，菌株酵性究并证实其抗癌功能。选及发酵乳是质研经乳酸菌发酵动物乳而制成的，因独特的产共滋味和特殊的营养价值而受到人们的喜爱。对发酵乳产品的轭亚检测，包括感官评价、油酸理化指标、污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量、乳酸菌数等。对发酵乳发酵性能的检测包括质构、流变、滋味、气味、持水性等指标。

目前，在原始发酵乳基础上加入其它营养物质，以提高发酵乳的营养特性、风味特性和发酵特性的产品越来越多。加入益生菌的发酵乳营养更加丰富，摄入的益生菌在人体内积累定植后，对改善宿主体内的微生态平衡具有重要作用，益生菌乳制品同时还具有缓解乳糖不耐症，抗高血压，降低生殖道感染风险，促进Ca²⁺吸收和维生素生成等功能。许多可生产CLA的菌株均为乳酸菌，可用于发酵。当使用能生产CLA的菌株生产功能性乳制品时，便可将CLA较好地融入产品中，从而利于乳制品的多种有益功能。有研究发现，将产CLA的乳酸乳球菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌复配后发酵牛奶，所得产物中CLA最大值为56.51mg/mL。目前大多CLA在食品中应用较少，如何能获得高产CLA的乳酸菌并应用于发酵乳中，具有较大的意义。本研究从发酵乳中筛选菌株，得到产共轭亚油酸的菌株，将其直接用于制作发酵乳，研究该菌株的发酵性能，测定CLA的产量，评估发酵乳的综合指标，以获得CLA含量高，品质好的发酵乳。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳样品和纯牛奶采自内蒙古呼和浩特和呼伦贝尔，采集后置于无菌容器，放于冰盒中带回。革兰氏染色液试剂盒，索莱宝科技有限公司（北京）；细菌DNA提取试剂盒，康为世纪生物科技有限公司（北京）；DL2000DNAMarker、DL15000DNAMarker，大连宝生物；2×EsTaqMasterMix（Dye）、6×SuperStainLoadingBuffer，北京康为世纪；溶菌酶，北京索莱宝；琼脂糖，北京中科瑞泰生物；亚油酸（LA），90%纯度，上海联迈生物；共轭亚油酸标准品（CLA），Sigma公司。

1.2 仪器与设备

PCR仪（Eppendorf）、高速冷冻离心机（Ep-pendorf），德国Eppendorf公司；超微量核酸蛋白定量仪（ThermoFisher），ThermoFisher公司；质构仪（BROOKFIELD），美国BROOKFIELD；电子舌（In-sent），日本Insent。

1.3 试验方法

1.3.1 传统发酵乳中乳酸菌的分离纯化

发酵乳梯度稀释后涂布MRS平板，37℃培养2d。挑取菌落状态不同的透明和半透明单菌落，每个单菌落经过3～4次划线纯化后，37℃，静置培养24～48h，保存备用。

1.3.2 革兰氏染色鉴定

挑取待检菌落于载玻片，滴入生理盐水稀释，固定后进行染色，具体操作见革兰氏染色液试剂盒说明书，染色后于显微镜下观察菌体形态。

1.3.3 CLA含量测定

选取CLA质量浓度为0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0μg/mL的样品，测定吸光度值（λ=233nm），制作标准曲线。选取革兰氏染色阳性菌株接种MRS培养基（0.5mg/mLLA），37℃培养24～48h，加入正己烷充分振荡，4℃，10000g离心10min，取上清液测定吸光度值（λ=233nm），根据标准曲线计算生成CLA的含量。

1.3.4 16srDNA鉴定菌种

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取已筛选的乳酸菌基因组，稀释基因组DNA至终质量浓度为20ng/μL，以此为模板，用16s通用引物进行PCR扩增，PCR验证结果呈阳性的菌株送交上海派森诺生物科技股份有限公司测序。

1.3.5 单因素试验

以发酵乳的质构特性、滋味特性和CLA产量作为考察指标，研究植物乳杆菌HAC01接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH值、LA添加量，发酵结束后后熟时间对发酵性质的影响。利用质构仪测定硬度、稠度、黏度、黏聚性等指标，测定条件及参数为：探针选择直径为2.5cm的平底圆柱形探针，测定模式选择阻力测试，感应力选择自动感应10g，测定前下降速度1.0mm/s，测定速率2.0mm/s，测定后速度8mm/s，进入样品深度20mm，对测试样品进行两次压缩，间隔时间5s。利用电子舌测定样品的综合味觉信息，指标包括酸、甜、苦、咸、鲜。

1.3.6 均匀设计

使用DPS数据处理系统V7.05进行均匀设计和数据分析，优化反应条件。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌分离纯化

为得到具有较高CLA产量的菌株，本试验从采集的发酵乳样品分离纯化菌种，利用菌落形态和革兰氏染色进行初步鉴定，结果如表1所示，乳酸菌菌落形态基本呈半透明、圆形隆起状，革兰氏染色为阳性。

2.2 菌株CLA含量

测定筛选出的25株革兰氏阳性菌的CLA产量，结果见图1所示，其中产量最高的为7号菌株，CLA产量为（2.7197±0.0056）μg/mL，选取产量相对高的10株菌进行后续试验；CLA标准曲线如图2所示，由标准曲线得到回归方程：Y=0.0741X+0.0032，线性相关系数R²=0.9991。

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