单枞茶酒的抗氧化活性评价（二）

①测定DPPH·清除能力

参考Kumaran等及Floegel等的单枞的抗方法并作改进。将单枞茶酒样品作一系列浓度地稀释，茶酒将每一稀释度样品溶液加到2支5mL试管中，氧化每支试管加0.2mL样品液；然后在一支试管中加入1×10^-4mol/L的活性DPPH乙醇溶液3.8mL，在另一支试管中加入3.8mL乙醇，单枞的抗两支试管充分摇匀后于室温下置于黑暗处孵育30min，茶酒然后于波长517nm处测定吸光度。氧化用乙醇作空白。活性按下式计算DPPH·清除率(I_D)：

I_D(％)=[1～(A₁—A₂)／Ao]×100

式中，单枞的抗A₁：0.2mL茶酒样液+3.8mLDPPH乙醇溶液的茶酒吸光度；

A₂：0.2mL茶酒样液+3.8mL乙醇的吸光度；

Ao：0.2mL乙醇+3.8mLDPPH乙醇溶液吸光度。

②测定ABTS·清除能力

参照Dudonne等的氧化方法并作改进。取7mmol／L的活性ABTS溶液5mL，加入到88μL0.14mol／LK₂S₂O₈溶液中，单枞的抗混匀，茶酒室温下避光静置12h，氧化即得ABTS·储备液。实验前用10mmo/LpH7.4的磷酸缓冲液稀释成工作液，使其在波长734nm下吸光度为0.70±0.02。将单枞茶酒作一系列浓度地稀释，取10μL样品液加到200μLABTS工作液中，混匀并静置6min后测定波长405nm下的吸光度。以纯溶剂作空白。按下式计算ABTS·清除率(I_A)：

I_A(％)=(1-A₁／Ao)×100

式中，A₁：茶酒样液的吸光度；

Ao：空白的吸光度。

③测定·OH清除能力

参考候学敏等的方法并稍作改进。将单枞茶酒样品液用dd水作一系列浓度地稀释。取10mL小试管若干，分别依次加入8mmol／。FeS0₄溶液2mL、8mmol／L水杨酸-乙醇溶液2mL以及不同浓度的单枞茶酒样品液2mL，以dd水作空白，最后加入8.5mol／LH₂0₂溶液2mL，摇匀后于40℃水浴中静置20min，然后4000r/min离心5min，取上清液于波长510nm处测定吸光度，参比溶液以dd水替代H₂O₂溶液。按下式计算·0H清除率(I_H)：

I_H(％)=[1-(A_n-A_d)／A_o]×100

式中，A_o：空白吸光度；

A_n：加入茶酒样液后吸光度；

A_d：参比溶液吸光度。

④测定0₂^-·清除能力

参考PaVithm等及候学敏等的方法并作改进。取10mL小试管若干，分别加入4.5mLpH8.O的Tris-盐酸缓冲液，于30℃水浴中静置15min，在各试管中分别加入0.2mL不同浓度的单枞茶酒样品液以及30℃预热过的3mmol／L的邻苯三酚溶液0.3mL(用10mmo/L盐酸配制)，摇匀后于30℃水浴中静置5min，然后迅速加入5滴8mol/L盐酸终止反应。用dd水作空白对照，在波长325nm处测定吸光度。按下式计算O₂^-·清除率(Is)：

I_s(％)=(A_o-A_n)／A_o×100

式中，A_o：空白的吸光度；

A_n：加入茶酒样液后的吸光度。

（4）抗氧化能力指数(ORAC)的测定

ORAC法是抗氧化研究领域关注较多的一种抗氧化活性评价方法，目前已成功应用于生物制品、食品、化学品及天然植物提取物等多种样品的抗氧化能力分析。具体测定步骤如下：

①准确称取AAPH0.414g，用75mmol／LpH7.4的磷酸缓冲液溶解并定容至10mL，即得153mmol／L的AAPH溶液。

②准确称取FL0.04g，用75mmol／LpH7.4的磷酸缓冲液溶解并定容至25mL，即得4.25mmol/L的FL贮液甲；吸取FL贮液甲0.05mL并以磷酸缓冲液定容至50mL，即得4.25×10-3mmol／L的FL贮液乙；然后将FL贮液甲和FL贮液乙置于4℃备用。实验时吸取FL贮液乙0.5mL并以磷酸缓冲液定容至25mL，可得8×10-3mmo儿的稀释液。

③准确称取2.5mgTrolox，用甲醇溶解并定容至10mL，即得1mmol／L的Trolox溶液。实验时分别吸取Trolox溶液l、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mL于10mL容量瓶，用75mmol/LpH7.4磷酸缓冲液定容，即得不同浓度Trolox溶液。

④量取单枞茶酒10mL置于lL容量瓶中，用75mmol/LpH7.4磷酸缓冲液定容，即得10mL/L的样品液。

⑤量取100μLFL稀释液置于96孔荧光板中，用酶标仪在激发波长490nm、发射波长514nm下测定荧光值(记作‰)。然后，加入不同浓度的TroloX溶液50μL并振摇2min，37℃下孵育8min后立即加入50μLAAPH溶液启动反应。反应期间，每隔2min便测一次荧光值(记作A_n)，直至荧光值衰减成直线。由下式计算荧光衰退曲线下的面积(AUC)，计算保护面积(NetAUC)，然后以NetAUC值为纵坐标，以TroloX溶液浓度为横坐标，建立标曲。

AUC=0.5×[2×(Ao+A₁+…+A_n+1+A_n)-A_o-A₁]×△t

NetAUC=AUC_sample-AUC_blank

⑥吸取样品液，按上述方法测定和计算单枞茶酒ORAC值。

二、结果与分析

1、单枞茶酒中儿茶素和GA测定结果

表2为儿茶素和GA标品的标曲方程。由决定系数R²可知方程均拟合良好。

图1为单枞茶酒中儿茶素和GA的HPLC分析图谱，表3为计算出的单枞茶酒中的儿茶素和GA含量。
 

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