浑浊红球菌PD630对黄曲霉毒素B1的生物降解特性研究（二）

（5）菌株接种浓度及培养基初始黄曲霉毒素B1浓度对降解效果的浑浊红球黄曲影响

菌株接种浓度及培养基初始AFB1浓度对降解效果的影响实验参考LinZhao等方法并作适当修改。取浑浊红球菌PD630菌种接种于NB培养基，菌P解特究震荡培养箱中（30⁰C，对的生160r/min）活化36h后得到PD630菌株活化液，霉毒调整0D600控为1.5。物降菌液按照10%接种量接种于含AFB1的性研无菌培养基中，AFB1终浓度为0.4μg/mL。浑浊红球黄曲无菌NB培养基代替PD630菌液作为空白对照。菌P解特究分别在培养0、对的生12、霉毒24、物降36、性研48、浑浊红球黄曲60和72h后提取样品中的菌P解特究AFB1，HPLC测定培养基中AFB1残余浓度，对的生分别接种1%、5%、10%、15%菌液于含AFB1的无菌NB培养基中，使AFB1终浓度为0.4μg/mL，无菌NB培养基作为空白对照。调整NB培养基中的AFB1使终浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0ug/mL，按10%接种量加入菌株活化液，以AFB1终浓度相同的无菌NB培养基作为空白对照。震荡培养箱培养（30⁰C，160r/min），分别于0、12、24、36、48、60和72h取样，提取培养液中残留的AFB1进行HPLC分析。

（6）无细胞上清、菌细胞悬液、胞内裂解物对黄曲霉毒素B1的降解活性

PD630菌株在30⁰C，160r/min条件下培养72h，菌株发酵液通过在4⁰C，8000r/min离心20min收集上清及细胞沉淀物：（a）上清液通过0.22μm无菌滤膜过滤后用于进一步实验；（b）菌体细胞沉淀用无菌生理盐水洗涤3次后再次用生，理盐水重悬，制备得到菌细胞悬液；（c）取部分菌悬液通过细胞超声破碎仪破碎后，细胞内容物在8000r/min，4⁰C离心20min，0.22μm滤膜过滤得到胞内裂解液；（d）取部分发酵液不作任何处理；（e）灭菌备用的NB培养基。

在上述所制备的5种处理液中分别加入AFB1，终浓度为0.4μg/mL。将培养体系置于30⁰C，180r/min黑暗温育72h后，提取AFB1进行HPLC分析。

（7）PD630菌株无细胞上清对黄曲霉毒素B1的降解效果，按PD630菌株在30⁰C，160r/min条件下培养72h，菌株发酵液通过在4⁰C，8000r/min离心20min收集上清及细胞沉淀物：（a）上清液通过0.22μm无菌滤膜过滤后用于进一步实验；（b）菌体细胞沉淀用无菌生理盐水洗涤3次后再次用生，理盐水重悬，制备得到菌细胞悬液；（c）取部分菌悬液通过细胞超声破碎仪破碎后，细胞内容物在8000r/min，4⁰C离心20min，0.22μm滤膜过滤得到胞内裂解液；（d）取部分发酵液不作任何处理；（e）灭菌备用的NB培养基。在上述所制备的5种处理液中分别加入AFB1，终浓度为0.4μg/mL。将培养体系置于30⁰C，180r/min黑暗温育72h后，提取AFB1进行HPLC分析。加入AFB1使终浓度为0.4μg/mL，在30⁰C，180r/min的黑暗条件下培育，分别在0、12、24、36、48、60、72h取样分析AFB1残留量。AFB1终浓度相同的无菌NB培养基作为空白对照。

（8）加热、EDTA、蛋白酶K对无细胞上清降解黄曲霉毒素B1活性的影响

根据XiulanSun等方法进行研究。为了探究无细胞上清中的活性成分性质，分别沸水浴处理20min；121⁰C高压灭菌锅处理10min；0.1MEDTA处理lh；1mg/mL蛋白酶K在55⁰C下处理lh。处理结束后在各处理上清液中加入AFB1，令AFB1终浓度为0.4ug/mL，在30⁰C，180r/min的培养条件下黑暗温育72h。AFB1终浓度相同的无菌NB培养基作为空白对照，温育结束后提取AFB1进行HPLC分析。

4、数据处理

采用Originpro2018和SPSS23.0对本文数据进行处理和分析，每组重复3次。

二、结果与讨论

1、黄曲霉毒素B1的提取及测定，通过：

①高效液相色谱法色谱条件

色谱柱：WatersC18柱（5μm，4.6x150mm）；流动相为乙腈：水=40：60（v/v）；流速：1.0mL/min；柱温：30⁰C；进样量20uL；检测器：紫外检测器；检测波长365nm。

②黄曲霉毒素B1标准曲线的制作及样品的处理标准

曲线的制作：将lmgAFB1标准品溶解于25mL色谱级甲醇中，得到40μug/mL标准储备液，保存于-20⁰C冰箱中。将该储备液用色谱级甲醇精密稀释，获得0.5、1、2、4、8μg/mL的标准曲线工作溶液。色谱柱：WatersC18柱（5μm，4.6x150mm）；流动相为乙腈：水=40：60（v/v）；流速：1.0mL/min；柱温：30⁰C；进样量20uL；检测器：紫外检测器；检测波长365nm。按色谱条件进行HPLC分析，以溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制AFB1标准曲线，计算得到回归方程为：y=74752x—4894.6，R2=0.9998的实验所述的高效液相色谱法测定得到黄曲霉毒素B1色谱图。

由图1可知，该高效液相色谱法对AFB1有良好的分离测定效果，AFB1在紫外波长为365nm的条件下出峰良好，峰形符合液相要求，出峰时间为3.8土0.5min。

2、添加标准品分析黄曲霉毒素B1提取测定方法回收率及精密度

依据方法学对黄曲霉毒素B1的提取测定方法进行了评估，以保证AFB1结果测定的可靠性。

AFBI分析方法的回收率及精密度如表1所示。

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