单枞茶酒的抗氧化活性评价（一）

茶酒，单枞的抗按生产工艺主要分为配制型茶酒和发酵型茶酒。茶酒其中，氧化配制型茶酒是活性将茶叶在酒中浸泡，再经勾兑、单枞的抗调配等工艺制成的茶酒酒精饮品；而发酵型茶酒则是以茶叶为主料，以糖、氧化果蔬汁等为配料，活性经酵母或酒曲发酵而成的单枞的抗饮用酒。目前，茶酒无论是氧化配制型茶酒还是发酵型茶酒，酒精度通常在20％vol以下，活性且酒中含有很多茶叶活性物质，单枞的抗因此一般将茶酒归为低度保健型酒。茶酒

据报道，氧化茶酒中通常含有一定量儿茶素、没食子酸(GA)等活性成分。儿茶素和GA作为重要的食品添加剂，其抗氧化活性已得到了广泛研究。但目前关于茶酒的抗氧化活性研究报道很少，仅何婷婷报道了一款发酵型普洱茶酒的抗氧化活性，认为该茶酒具有良好的还原能力和清除超氧自由基的能力。

单枞茶酒是我们课题组以单枞茶为原料研制的一款发酵型茶酒。本研究先对单枞茶酒的儿茶素及没食子酸进行高效液相色谱(HPLC)测定，然后从方面对单枞茶酒的抗氧化活性进行综合评价：(1)还原能力的测定；(2)清除自由基能力的测定；(3)抗氧化能力指数(ORAC)的测定。这三方面是抗氧化活性的主要测定方法，尤其ORAC测定是目前抗氧化研究领域研究热门、应用广泛的一项重要评价方法。本研究可为单枞茶酒的保健功能研究提供基础数据和理论参考。

一、材料与方法

1、实验材料

单枞茶酒，本课题组制备，具体制备工艺如下：以潮州凤凰单枞茶(一级品)为原料，先按茶水比1：40(g/mL)加85℃水浸提茶叶10min以获得茶汁，然后加人蔗糖至糖度为15^oBx。再添加30g，L硫酸铵作为氮源，并以柠檬酸调pH至4.0。将茶酒酵母T-5(酿酒酵母ATCC204508经茶汁驯化而得，本单位保藏)接入麦芽汁培养成浓度为10⁶cfu/mL的种子液，然后添加到茶汁中进行发酵。发酵条件：接种量为体积百分比3.1％，发酵温度为21℃，发酵时间8d。茶酒制备完毕后密封避光储藏。

2、主要药品试剂

乙腈和甲醇(色谱纯)，美国J.T.Baker公司；4种主要儿茶素标品表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子酸儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及没食子酸(GA)标品，纯度均≥98％(HPLC)，合肥博美生物科技有限责任公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、2，2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH)、水溶性维生素E(Trolox)，美国Sigma-Aldrich公司；荧光素钠(FL)，美国Fluka公司；甲酸、L(+)-抗坏血酸、K₂S₂0₈、K₃[Fe(CN)₆]、Na₂HP0₄、NaH₂P0₄、三氯乙酸(TCA)、FeCl₃、食用酒精、十二烷基硫酸钠(SDS)、邻苯三酚、水杨酸、H₂0₂、Al(N0₃)₃、FeS0₄、NaN0₂、Na₂S₂0₃、NaOH、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸铵、柠檬酸、乙醇、盐酸等均为国产分析纯；pH8.OTris-盐酸缓冲液的配制：精确称取121.1gTris于1000mL容量瓶中，加入800mLdd水，充分搅拌溶解。再加入42mL盐酸，dd水定容。

3、主要仪器设备

KQ-300VDE三频超声波震荡器，上海五相仪器仪表有限公司；Agilent1260LC高效液相色谱仪，美国AGILENT公司；MK3型酶标仪，芬兰ThemoLabsystems公司；U-3010型紫外可见分光光度计，日本HTACHI公司；TDL-16C型高速台式离心机，上海安亨科学仪器厂；HH-8型数显恒温水浴锅，金坛市精达仪器制造厂，96孔荧光板，丹麦NUNC公司。

4、实验方法

（1）单枞茶酒中儿茶素和GA的HPLC测定

先将儿茶素和GA标品分别配成5mg/mL的单标溶液，然后再混合并配成l、2、4、8、10、20mg/L的混标溶液，然后进行HPLC测定，建立各标品的标曲方程。然后再将茶酒样品HPLC测定，并通过标曲方程计算出茶酒中的儿茶素和GA含量。

HPLC色谱条件：AgilentZORBAxSB-C₁₈(4.6×250mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)，0.2％甲酸水溶液(B)；流速：1.2min；柱温：25℃；进样量：10μL；紫外检测波长：278nm；梯度洗脱，程序如表1。

（2）单枞茶酒还原能力的测定

还原能力测定依据的是物质供电子能力大小的原理。参考何婷婷的方法并作改进。在5支10mL试管中分别滴入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL单枞茶酒，分别用dd水补至1.0mL，加入0.2mol/LpH6.6的磷酸缓冲液2.5mL，再加入1％的K₃[Fe(CN)₆]2.5mL，振荡混匀，然后于50℃水浴中反应15min并迅速冷却。加入10％的TCA1.0mL，振荡混匀，4000r/min离心5min。取上清液2.5mL，加入2.5mLdd水和0.5mL0.1％的FeCl₃，混匀后静置15min，于700nm波长处测定吸光度Ao，以dd水代替Fecl₃作空白，操作如上，测出吸光度氏，用两吸光度差值表示还原能力大小，即：还原能力=A₁-Ao。

将食用酒精与蒸馏水勾兑，使酒精度达到单枞茶酒的酒精度8.35％vol。然后将该勾兑酒及0.1mg/mL的抗坏血酸作为对照，测定方法如上。

（3）单枞茶酒清除自由基能力的测定

单枞茶酒对DPPH·、ABTS·、·OH以及O₂·四种自由基的清除能力强弱，也可作为反映单枞茶酒抗氧化活性强弱的一项依据。分别对单枞茶酒清除上述自由基的能力进行测定，同时，各测定过程中均以0.1mg/mL的抗坏血酸作对照。

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