一种高效、准确测定油菜中维生素C含量的方法（一）

油菜（BrassicanapusL.）属于芸薹科（Brassicaceae）芸薹属（Brassica），种高是效准我国主要的油料作物。随着2015年国家油菜籽临时收储政策的确测取消以及国外进口冲击的影响，油菜生产的定油的方比较效益严重下降，在很大程度上影响了我国农民种植油菜的菜中积极性。甘蓝型油菜是维生由甘蓝和白菜经过自然杂交后再加倍后形成的，其两个祖先都是含量深受广大消费者喜欢的可口蔬菜，从起源与进化的种高角度来看，将油菜开发为蔬菜具有良好的效准科学基础和巨大的潜力。近年来在浙江、确测湖北、定油的方湖南、菜中江苏等长江流域主产区，维生因地制宜总结出“菜用+油用”、含量“菜用+花用+油用”等多种油菜高效利用开发模式。种高有研究表明，在适当的种植条件下，收获油菜薹后并不会对油菜籽的产量造成显著影响，此模式可有效增加农民种植油菜的生产效益。在长江流域油菜主产区，油菜作为冬季作物，不会影响到主要粮食作物的种植。利用冬闲田种植油菜，采用油蔬两用技术(即先割菜薹，后收菜籽)，对提升油菜种植的整体效益，增加农民收入，促进我国油菜产业发展具有重要意义。

油菜幼苗（5叶期）以及油菜薹中都含有丰富的维生素C以及其它营养物质，具有很高的食用价值。培育高维生素C油菜薹品种，既可提升油菜薹的菜用价值，也可为消费者提供健康营养的功能型蔬菜。维生素C又称为抗坏血酸，是人体必需的主要维生素之一。对于一个普通成年人，人体所需的绝大多数其它维生素膳食推荐供应量都在20mg/d以下，而维生素C的膳食推荐供应量却为100mg/d，是人体中需求量最大的一种维生素，当人体严重缺乏维生素C时会引起坏血病，还会造成人体免疫力的下降。维生素C是蔬菜和水果中最常见的抗氧化剂，参与人体内的多种氧化还原反应。有研究表明，维生素C不仅可以预防癌症，减少癌症的发生率，还可以改善和提高人体的免疫功能，同时具有预防心血管疾病的重要功能。人体自身无法合成维生素C，必须要从新鲜的蔬菜、水果等食物中获取。准确并快速地测定出食物中的维生素C含量，对保证人体日常维生素C的摄取具有重要意义。

目前测定食物中维生素C含量的检测方法主要有：碘酸钾滴定法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等，但大多操作繁琐、测定效率不高等问题。在现行标准GB5009.86-2016中规定了高效液相色谱法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法为测定食品中抗坏血酸的方法，其中2,6-二氯靛酚滴定法，操作简单，但是如果样品中有色素等物质会对滴定结果造成影响；荧光法耗时较长；而高效液相色谱法是一种简单、高效、准确的测定方法。但目前国标中的高效液相色谱法采用的样品前处理比较繁琐，一个样品从处理到上机检测至少需要15min，测定效率不高。在对大群体样本的维生素C进行检测时，如何快速并准确筛选出高维生素C含量材料，提高维生素C检测方法的效率就显得尤为重要。

维生素C是一种水溶性维生素，分子式为C₆H₈O₆，分子中相邻的两个羟基极易发生分解并释放出H⁺，呈酸性并具有很强的还原性，导致维生素C极其不稳定。况且维生素C在常温条件下易降解，样品的贮藏条件影响检测结果的准确性。为此本研究在国标的基础上优化了测定维生素C的高效液相色谱法，改进后的方法可快速准确地测定样品中维生素C的含量，同时利用液氮贮藏并研磨油菜样品，使得该方法可操作期长、检测结果重复性好、精确灵敏、回收率高，能长期保存，可用于大群体样本中维生素C的分析鉴定及遗传解析，为进一步研究油菜中维生素C的合成和遗传机制奠定了方法基础，有利于培育富含维生素C的油菜新品种。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年10月至11月在中国农业科学院油料作物研究所阳逻试验基地所取的油菜幼苗（甘蓝型油菜关联群体材料，取样时期为播种后30d左右）以及小白菜（兔子腿矮脚黄）、生菜（意大利全年耐抽薹生菜）、菠菜（大圆叶菠菜）（每种蔬菜的取样时间均处于可食用状态）。每种油菜选择5株大小相近的材料（去掉油菜的根部和部分黄叶），小白菜、生菜、菠菜同样各取大小相近的5株（去掉蔬菜的根部和部分黄叶）。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪（e2695，美国Waters公司）、PDA检测器（2998，美国Waters公司）、色谱柱（C18柱，柱长250nm，内径4.6nm，粒径5μm，美国Waters公司）、瓶口分液器（5-50mL，德国Eppendorf公司）、万分之一天平（JJ124BC，常熟市双杰测试仪器厂）、十万分之一天平（AUW220D，日本岛津公司）、均质机（AD500S-P，上海昂尼仪器有限公司）、超声波清洗机（SB25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）、真空抽滤装置（DET-01P，达尔拓公司）、多功能粉碎机（JYS-M01，九阳股份有限公司）。

盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）、超纯水（色谱纯，Rephile-watersystem)、维生素C标准品（纯度99%以上，德国Sigma-Aldrich公司）、乙酸铵（优级纯，德国Sigma-Aldrich公司）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）。
尼龙66（Nylon）滤膜（直径25mm、孔径0.45μm，天津市津腾实验设备有限公司）、尼龙66（Nylon）滤膜（直径13mm、孔径0.22μm，天津市津腾实验设备有限公司）、微孔水相滤膜（直径50mm、孔径0.25μm，天津市津腾实验设备有限公司）、2mL色谱进样瓶（上海安谱实验科技股份有限公司）、内插管（250μL，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

提取液（1%HCl溶液）的配制：用移液枪吸取10mL盐酸（优级纯）于1000mL容量瓶中，加超纯水定容，摇匀后备用。
流动相（20mmol/L的乙酸铵）：用万分之一的天平称取1.54g乙酸铵，溶解于200mL的超纯水中，超声15min后，再用超纯水定容至1000mL后继续超声脱气15min。超声结束后用真空抽滤泵过微孔水相滤膜（0.22μm）进行抽滤，过滤后的溶液装入流动相瓶中备用。为避免因流动相的原因影响检测结果的准确性，20mmol/L的乙酸铵需现配现用。

维生素C标准溶液(1000μg/mL)：用十万分之一的天平准确称取0.1g维生素C标准品于100mL棕色容量瓶中，用1%的盐酸溶解并定容，充分摇匀后放置在4℃冰箱中避光保存。

1.3.2 鲜样品的前处理

用万分之一的天平准确称取2g新鲜油菜或蔬菜样品的叶片，置于50mL离心管中，并加入40mL提取液（即1%的HCl），用均质机将样品完全均质破碎。用5mL注射器吸取已均质的样品匀浆，过两层滤膜（0.45μm+0.22μm），滤液过滤到250μL的内插管中，待上机检测。

样品储存：将新鲜油菜或蔬菜样品分别贮藏在4℃、-20℃、液氮（-196℃）条件下。3d后，将贮藏在4℃、-20℃的一部分样品放入液氮中速冻，用多功能粉碎机磨成粉末状（用之前先用液氮进行预冷），并置于50mL离心管中；剩余样品不进行研磨处理，直接称取2g样品，其它处理方法和检测方法相同。测定出不同贮藏条件以及不同处理方式下油菜和蔬菜样品中维生素C的含量。

1.3.3 高效液相色谱仪（HPLC）的检测条件

色谱柱，美国WatersXBridge-C18色谱柱；流动相，甲醇和20mmol/L乙酸铵（两者比例为7:93）；流速，1.0mL/min；进样量，10μL；目标柱温，25℃；检测波长，245nm；维生素C的保留时间，2.7min。

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