维氏气单胞菌中介导的群体感应现象及大蒜提取物的干扰作用（一）

微生物的维氏生长繁殖和代谢是导致食品腐败变质的重要因素。细菌群体感应（QuorumSenSIng，气单群体取物QS）是胞菌一种依赖于细胞密度的信息交流方式，以自诱导物（AuToInducerS，中介AIS）为群体感应信号分子，导的的干它通过调控食品中优势腐败菌的现象生长代谢来调控食品腐败进程。研究表明，蒜提群体感应抑制剂可通过与AIS受体蛋白结合，扰作降解AIS分子和阻断群体感应通路等途径有效干扰细菌群体感应的维氏表达，降低食源性细菌的气单群体取物致病性或致腐性。利用群体感应抑制剂靶向调控细菌的胞菌群体感应系统来抑制食品腐败，已成为食品保鲜领域的中介研究热点之一。

近年来，导的的干研究学者在水果、现象蔬菜和中草药等天然植物的蒜提提取物中筛选到很多安全、有效的活性成分，这些物质作为群体感应抑制剂可有效降低微生物的毒性。大蒜提取物是具有群体感应抑制活性的物质，能在亚抑菌浓度下阻断N-酰基高丝氨酸内酯（AHLS）信号分子介导的群体感应系统，抑制其毒力因子产生，然而，目前关于大蒜提取物对腐败菌腐败能力的干扰作用仍少有报道。

本试验以在发酵鱼糜中筛选到的腐败菌维氏气单胞菌为对象，分析其AHLS介导的群体感应现象，探究大蒜提取物对该细菌产AHLS活性、生物膜形成能力、毒力基因表达和致腐能力的干扰作用，以期利用大蒜提取物等群体感应抑制剂作为食品保鲜剂，提高食品的安全性和货架期。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：新鲜大蒜，购于杭州市潮王路菜市场；鱼糜，A级海产铜盆鱼糜，由上虞市傣之味食品有限公司提供，贮藏于-18℃冰箱中，备用。菌种：维氏气单胞菌，分离于发酵鱼糜，添加20%甘油，保存于本实验室-80℃冰箱中。根癌农杆菌[AgrobActeriumtumefAeiensA136（PcF218/PcF372）]，壮观霉素抗性，用量为50μg/mL。

试剂：甲酸、乙酸乙酯、二甲基亚砜（DmSO）、甲苯为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、结晶紫、吖啶橙、壮观霉素、细菌基因组DnA快速抽提试剂盒、细菌总RnA快速抽提试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RP-c18F254S反相薄层层析板，德国merck公司；AHLS标准品，美国SIgma公司。
1.2仪器与设备

SPecTramaxm5酶标仪，美国molecularDevIceS公司；LIFeEcoPcR仪，杭州博日科技有限公司；FV300激光共聚焦显微镜，日本OLYmPUS公司；STePOne型荧光定量PcR仪，美国ABI公司；PHS-3c型数显酸度计，上海精科仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；e2695型高效液相色谱仪，美国WaTerS公司；YXQ-LS-SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌产AHLS分子检测

参照Ravn等的方法，采用生物报告菌法分析细菌产AHLS分子的活性和种类。

采用平行划线法分析AHLS的产生情况，在含1%琼脂的LB平板上涂布40μLX-gal（20mg/mL），将活化12h的根癌农杆菌与待测菌平行划线，于30℃中培养24h，观察根癌农杆菌的颜色变化。

将待测菌培养液离心（8000×g，5mIn，4℃），上清液用等量酸化乙酸乙酯（0.5%甲酸）提取2～3次，合并有机相，旋转蒸发仪蒸干溶剂，用DmSO重新溶解，于-20℃保存待用。

采用平板扩散法分析AHLS活性变化，100mL含1%琼脂的LB培养基中加入4～10mL活化的根癌农杆菌和500μLX-gal（20mg/mL），混合均匀后倾注平板，待冷却凝固后打孔，加入40μL待测菌AHLS提取液，于30℃中培养36～48h，观察平板的颜色变化。

采用薄层色谱法（TLc）分析细菌产生AHLS种类，取1～10μLAHLS标准品与细菌AHLS提取物样品，点样于c18反相薄层层析板。用层析液甲醇-水（体积比60/40）充分展开，取出后在常温下挥干溶剂。制备含根癌农杆菌的固体培养基，倾于板上，凝固后在30℃无菌密闭容器中培养36～48h，观察颜色变化。AHLS标准品的浓度分别为：0.1mmol/LN-丁酰基-高丝氨酸内酯（c4-HSL）、10μmol/LN-己酰基-高丝氨酸内酯（c6-HSL）、0.04μmol/LN-庚酰基-高丝氨酸内酯（c7-HSL）、0.06μmol/LN-辛酰基-高丝氨酸内酯（c8-HSL）、0.8nmol/L3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯（oxo-c6-HSL）和1.6nmol/L3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯（oxo-c8-HSL）。

1.3.2 细菌的生长曲线及培养液PH值的测定

将活化12h的待测菌接种到100mLLB液体培养基中，在30℃下摇床培养24h，间隔一定时间取样，参照GB/T4789.2-2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》计数，同时利用酸度计测定培养液PH值的变化。

1.3.3 基因分析

采用PcR技术分析细菌的luxRI同源基因、鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）、赖氨酸脱羧酶基因（LDC）、鞭毛基因（flA）、弹性蛋白酶（AhyB）、丝氨酸蛋白酶基因（ser）、脂肪酶基因（liP）。将细菌过夜活化，利用细菌DnA提取试剂盒提取细菌DnA模板，使用的引物见表1。50μL反应体系，PcR扩增程序为：预变性95℃3mIn，变性95℃30S，退火55℃1mIn，延伸72℃1mIn（35个循环），终延伸72℃10mIn。其中，扩增AhyB和flA基因时退火温度为59℃。将扩增到的基因片段进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下成像，同时送往生工生物工程有限公司测序。将得到的序列进行BLAST搜索和同源性分析。

1.3.4 大蒜提取物的制备

参照RaSmuSSen等的方法制备大蒜提取物。将市售大蒜去皮，称取150g于300mL甲苯中匀浆，萃取12h后用WhaTman1号滤纸过滤。向滤液中加入150mL无菌水，在室温条件下搅拌24h，两相分离得水相，经0.22μm滤膜过滤后得1g/mL大蒜提取物。通过二倍稀释法确定大蒜提取物对待测菌的最小抑菌浓度。

1.3.5 β-半乳糖酶活性的测定

将待测菌过夜活化12h，取500μL细菌培养液接种至100mLLB液体培养基中，分别加入1mL不同质量浓度的大蒜提取物（终质量浓度为0.15～1.20mg/mL），以无菌生理盐水为对照，于30℃摇床中振荡培养12h，将培养液离心（8000×g，10mIn）得上清液。参照mIller的方法测定生物报告菌的β-半乳糖酶活性。

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