猪肉和鸡肉中11种同化激素残留超高效液相色谱

3 讨论

3.1 仪器条件选择

3.1.1 MS/MS特征离子的猪肉种同选择

对于动物肌肉组织中多种甾体激素的分析，采用串联质谱MRM模式采集信号。和鸡化激在ESI⁺电离方式下，肉中11种甾体激素都可形成稳定的素残色谱[M+H]⁺准分子离子峰，然后进行相应的留超子离子全扫描，以确定MRM特征诊断离子，高效11种甾体激素选择的液相特征离子见表1,每种药物选择两个离子对。

3.1.2 液相条件的猪肉种同优化

基于超高效液相色谱分离的特点和要求，在优化的和鸡化激流动相条件下，11种甾体激素药物在 15 min内实现良好的肉中分离，峰形对称，素残色谱不拖尾，留超图1为11种激素在猪肉中的高效MRM离子流色谱图。考虑到同化激素容易受到内源性干扰，液相选用的猪肉种同色谱柱不宜过短，因此选择了长度为150 mm的色谱柱。11种同化激素在温度高于45 ℃时易于分解，而色谱柱温度较低时分离洗脱效果较低，且出峰较慢。流动相中加入适量的甲酸溶液有利于11种激素都可形成稳定的[M+H]+准分子离子。试验对比了有机溶剂乙腈/甲醇(A相)与水/0.1%甲酸水溶液(B相)分离目标化合物的效果。在0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流动体系中，采用梯度洗脱，可实现 11种甾体激素药物的快速分离，且峰形良好。

3.2 样品前处理方法优化

3.2.1 除脂

动物组织含有的脂肪会影响检测方法的灵敏度，本研究对比了使用乙腈饱和的正己烷和低温冷冻两种方法以及两种方法相结合的除脂效果。当使用乙腈饱和的正己烷进行除脂，结果表明丙酸睾酮和丙酸诺龙的回收率均低于30%,而苯丙酸诺龙几乎检测不到，且其余8种药物的回收率相对于用冷冻除脂的方法也有所降低，因此选择冷冻除脂。

3.2.2 提取溶剂的选择

试验对比了叔丁基甲醚、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等溶剂或混合溶液的提取效果，发现叔丁基甲醚提取时，康力龙、丙酸睾酮、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙的回收率低于30%。乙酸乙酯提取时，康力龙、苯丙酸诺龙的回收率低于55%。以甲醇-乙腈(1∶1,v/v)提取时各个药物的回收率较高，且易于浓缩，最终选择甲醇-乙腈(1∶1,v/v)作为提取液。

3.2.3 固相萃取法的优化

3.2.3.1 固相萃取柱的选择

考虑到经有机试剂提取肌肉组织容易得到较多杂物，本试验采用最常用的净化方式固相萃取净化。由于类物质为中等极性或者弱极性，目前报道中多采用MCX、HLB和C₁₈固相萃取小柱。本试验对比了11种同化激素在MCX、HLB和C₁₈两种固相萃取小柱上吸附效果，当使用 MCX 柱进行净化时，大部分药物的回收率低于30%。与HLB固相萃取柱相比，各个药物在C₁₈固相萃取柱上回收率均较高，同时考虑其成本相对较低，最终选择C₁₈柱。

3.2.3.2 淋洗液的选择

在固相萃取过程中，需要尽可能地洗掉的干扰组分，且需保证所测目标化合物不被洗脱下来。本试验所测目标化合物易溶于甲醇，选用的固相萃取柱的淋洗溶剂一般采用甲醇，因此，本研究采用加入含所测药物混合标准溶液的空白样品进行试验，选择不同浓度的甲醇水作为淋洗溶液，比较淋洗效果。试验结果表明，当淋洗液为20%甲醇水淋洗的目标化合的回收率相对较高，30%甲醇水淋洗液的回收率稍偏高；另外，随着甲醇的含量增加，即甲醇含量高于30%时，目标化合物未被固相萃取柱保留而导致回收率降低。主要原因由于目标化合物能溶解于有机试剂甲醇中，在淋洗过程中，随着甲醇的含量的增加，其洗脱的能力也增加，因此，造成目标化合物在淋洗过程中被冲洗，造成了回收率的降低，最终选取30%甲醇作为淋洗溶液。

3.2.3.3 洗脱液的选择

本试验选用甲醇、乙腈及混合溶剂甲醇/乙腈(1∶1,v/v)对目标化合物进行洗脱。试验结果表明，在洗脱剂用量不变的条件下，甲醇与乙腈的洗脱能力相当，乙腈稍高于甲醇的洗脱能力；而当选择甲醇作为洗脱液时，群勃龙和勃地龙的回收率相对于乙腈洗脱时低，且杂质增多；以混合溶剂甲醇/乙腈(1∶1,v/v)对目标化合物进行洗脱时，洗脱速度相对较慢，杂质也相对较多，因此，最终选择乙腈溶液作为最佳洗脱溶剂。

本试验对洗脱溶剂乙腈不同洗脱体积(2 mL,3 mL,4 mL,5 mL)对目标化合物的洗脱能力，试验结果表明，当洗脱液体积为2 mL 时，整体目标化合物的回收率较低；当升高洗脱溶剂至3 mL 时，其回收率相对增加；当采用5 mL洗脱液体积时，回收率有降低的趋势；洗脱液的体积与氮吹浓缩的时间有关，故在一定程度上影响了前处理的时间。因此，考虑回收率与经济实惠等因素，最终选定4 mL洗脱液体积为最佳选择。

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱测定11种同化激素的方法，以猪肉、鸡肉为检测基质，证明了方法的可应用性，为肉品中同化激素的检测提供了可选择的方法。

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