新鲜和干制龙眼果肉多糖免疫调节活性的分析（一）

多糖是新鲜性南10个以上的单糖单元以糖苷键连接组成的大分子，其广泛参与细胞的和干黏附、免疫、制龙增殖和分化。眼果疫调近年来，肉多天然来源的糖免多糖因其具有的生物学活性，在药理学和生物化学领域引起了广泛关注阳。节活目前，分析已有香菇多糖、新鲜性灵芝多糖、和干黄芪多糖等几种天然来源的制龙多糖被应用于临床或临床前研究。研究发现，眼果疫调黄芪多糖具有激活巨噬细胞、肉多调节TIB细胞和机体免疫的糖免功能。桑葚多糖可增加NK细胞活性，节活促进T/B淋巴细胞增殖，增强机体特异性和非特异性免疫。灵芝多糖可促进树突状细胞的成熟，在癌症免疫治疗过程中诱导T细胞增殖。同时，多糖具有补益心脾、缓解神经疼痛和消除肿胀等功效。

龙眼是一种亚热带特色水果，除我国外，在南亚地区、美国和澳大利亚也有种植。目前我国龙眼种植面积和产量均居世界首位。干制龙眼(桂圆)是我国药典收录的一味中药，具有补益心脾、缓解神经疼痛和消除肿胀的功效。现代药理学研究表明，多糖是龙眼肉生物活性的主要物质基础之一，报道显示龙眼多糖具有抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等生物活性。

由于龙眼产期集中，除鲜食外，其主要的加工方式为干制。文献显示，干燥过程可能会对多糖的结构和生物活性产生显著影响。韩苗苗等对龙眼干燥过程中其总多糖的活性变化进行了分析，发现热风干燥12～60h，其总多糖对DPPH、羟自南基清除能力和总抗氧化能力显著提高：干燥12～24h时.总多糖抑制SGC7901和HepG2肿瘤细胞的能力显著增强。但是由于没有分析单一多糖组分的活性变化，作者推测多糖的生物活性差异可能与美拉德反应关联的多糖一蛋白质相互作用有关。基于以上研究背景，作者采用小鼠肠系膜淋巴结细胞和巨噬细胞模型，分析了分离纯化获得的新鲜和干制龙眼果肉多糖的免疫调节活性，旨在为龙眼的精深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

龙眼(品种“储良”)：购自广州市天平架水果市场，65℃鼓风干燥去皮、去核后的鲜龙眼至水分含量为11.4％，备用。小鼠巨噬细胞(RAW264.7)：中山大学中山医学院提供；昆明小鼠(SPF级)：购白海南省药物研究所；RPMI-1640培养基、FBS(胎牛血清)和DMEM培养基：购白赛默飞世尔科技(中国)有限公司；中性红、MTT(噻唑蓝)、LPS(脂多糖)：购自西格玛奥德里奇公司；D301-R大孔吸附树脂：购自南开大学树脂公司；小鼠TNF-OL试剂盒、IL-6试剂盒：购自美国R&D公司：DEAE-FF阴离子交换树脂：购自美国通用公司。AlphaLDPlus型真空冷冻干燥机：德国MARTINCHRIST公司产品：1200高效液相色谱仪(HPLC)：安捷伦科技(中国)有限公司产品；SW-CJ-IF型超净工作台：苏州净化设备有限公司产品；SpectraMax190型全自动酶标仪：美谷分子仪器(上海)有限公司产品：311型二氧化碳培养箱：赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜龙眼和干龙眼多糖的制备

鲜龙眼多糖(LPX3)制备：新鲜龙眼去皮、去核，打浆，料液体积比为1:15，80℃水浴搅拌2h，200目纱布过滤。果渣复提2次。将合并的滤液浓缩至总糖质量分数为2％～4％。体积分数80％乙醇溶液醇沉24h，离心，少量蒸馏水复溶沉淀。加入D301-R大孔树脂，在pH5.0、温度48℃、料液体积比61:100、时间2h条件下脱色素和除蛋白质。100目纱布过滤，浓缩后透析48h，浓缩得粗龙眼多糖。将阴离子交换树脂装入1.6cm×30.0cm的层析柱中，蒸馏水冲洗干净后用pH9.0的Tris-HCl缓冲液平衡，上样，流量为0.5mL/min。洗脱程序为：0.0mol/LNaCl洗脱30min，0.03mol/LNaCl洗脱120min，0.05mol/LNaCl洗脱60min。检测洗脱峰，将0.05mol/LNaCl洗脱得到的组分浓缩，透析48h，浓缩得到粗龙眼多糖。得到的粗龙眼多糖采用安捷伦1200HPLC、TSKgel-G4000PWXL串联TSKgel-G3000PWXL纯化,以示差检测器检测并收集相应均一组分，浓缩，冷冻干燥后得到LPX3。

干龙眼多糖(LPG2)制备：体积分数80％的乙醇溶液浸泡干龙眼肉48h，阴干后打浆，80℃水浴浸提2h，料液体积比1:15，200目纱布过滤。果渣复提2次。提取纯化过程同上所述。

1.2.2 小鼠肠系膜淋巴结细胞的制备

小鼠推颈处死，移至超净台内，取肠系膜淋巴结。剪碎过200目不锈钢筛网，PBS冲洗2次，收集细胞。常温1000r/min离心5min收集细胞，用适量RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度。37℃、体积分数5％CO₂培养备用。

1.2.3 肠系膜淋巴结细胞增殖能力的测定

肠系膜淋巴结细胞增殖能力的测定参照文献，简述如下：细胞浓度调整至5×10⁶个/mL，接种至96孔板。样品组用不同质量浓度(6.25、25、200μL)的LPX3和LPG2孵育细胞。以等量RPMI-1640完全培养基为空白对照组，并设置6个平行。培养72h后加入MTT溶液(5.0mg/mL)20ILL，37℃孵育4h。加入三联液100μL，37℃再次孵育4h。酶标仪测定490nm处吸光度。计算公式如下：

式中：I为细胞增殖分数，％；A₁为不同质量浓度LPX3和LPG2组肠系膜淋巴结细胞加入MTT和三联液处理后在490nm处吸光度；A₂为空白对照组肠系膜淋巴结细胞加入MTT和三联液处理后在490nm处吸光度。

1.2.4 巨噬细胞增殖能力的测定

巨噬细胞增殖能力的测定参照文献方法执行，简述如下：调整细胞浓度至2×105个/mL，接种至96孔板培养2.0h，吸去培养基。加入100μLDMEM完全培养基，37℃、体积分数5％CO₂培养12h后吸去培养基。样品组加入不同质量浓度(100、200、400μg/mL)LPX3和LPG2。空白对照组加入等量的DMEM完全培养基，每组6个平行。培养24h后加入MTT溶液(5.0mg/mL)20μL，37℃继续孵育4.0h。吸去培养基，加入DMSO150μL。酶标仪振荡10min后，测定490nm处吸光度。计算公式如下：

式中：I为细胞增殖分数，％；A₃为不同质量浓度LPX3和LPG2组巨噬细胞加入MTT和三联液处理后在490nm处吸光度：A₄为空白对照组巨噬细胞加入MTT和三联液处理后在490nm处吸光度。

1.2.5 巨噬细胞吞噬能力的测定

巨噬细胞吞噬能力的测定参照文献，简述如下：调整细胞浓度至2×10⁵个/mL，接种至96孔板培养2.0h后，吸去培养基。加入100μLDMEM完全培养基，37℃、体积分数5％CO2培养12h后吸去培养基。样品组加入不同质量浓度(50、200、400μg/mL)的LPX3和LPG2。空白对照组加入等量的DMEM完全培养基，阳性对照组加入等量LPS(5μg/mL)，每组6个平行。37℃孵育24h，PBS清洗2次后加入100μL的质量分数0.1％中性红溶液。37℃孵育1h后用PBS洗掉未吞噬的中性红。加入200μL细胞裂解液(乙醇和冰乙酸体积比为1:1)，4℃静置过夜，酶标仪测定540nm处吸光度。计算公式如下：

式中：S为吞噬分数，％；A₅组为不同质量浓度LPX3和LPG2组巨噬细胞加入中性红溶液处理后在540nm处吸光度；A₆为对照组巨噬细胞加入中性红溶液处理后在540nm处吸光度。

1.2.6 巨噬细胞NO、1L-6和TNF-α分泌量的测定

巨噬细胞N0、IL-6和TNF-α分泌量的测定参照文献，简述如下：调整细胞浓度至2×105个/mL，接种2.0h后，吸去培养基。加入100μLDMEM完全培养基，37℃、体积分数5％CO₂培养12h，吸去培养基。样品组加入200μL相应质量浓度的LPX3和LPG2。空白对照组加入等量的DMEM培养基，阳性对照组加人等量LPS(5μg/mL)，每组6个平行。37℃培养24h后，培养液5000r/min离心5min，上清液中IL-6和TNF-α的质量浓度用ELISA试剂盒检测。NO测定组每孔加入50μL的NO荧光探针。37℃孵育30.0min后PBS清洗3次。荧光显微镜下观察并测定荧光强度，根据标准曲线计算NO分泌量。

1.3 数据统计分析

实验结果均表示为平均数±标准差。组问显著性分析采用SPSS22.0软件，单因素分析法(ANOVA)，Duncan检验，置信度为P＜0.05。

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