水产品腐败希瓦氏菌冷激蛋白的结构与功能分析（一）

水产品口感鲜美、水产营养丰富，品腐深受消费者的败希白喜爱，然而，瓦氏水产品极易腐败变质，菌冷激蛋结构造成巨大的分析经济损失。由于微生物的水产生长和入侵是导致水产品腐败的主要因素，因此水产品的品腐保鲜过程中对微生物的抑制十分重要。低温保鲜技术是败希白使用最早，也是瓦氏应用最广的水产品保鲜技术。低温会使微生物的菌冷激蛋结构生理机能发生重要的变化，比如膜流动性降低，分析核酸二级结构稳定性增强，水产转录、品腐翻译及蛋白折叠的败希白效率降低等。在低温下有些微生物仍能以一定的生长速率生长，即使生长较慢。腐败希瓦氏菌是一种耐冷菌，在0℃下也能生长、繁殖，其在有氧冷冻或冷藏状态下是多种水产品的特定腐败菌，引起冷藏水产品的腐败变质，这严重降低了水产品的品质，极有可能导致食品安全问题。鉴于水产品保鲜的重要经济价值，深入了解腐败希瓦氏菌低温适应的分子机制，可以辅助预测腐败菌在冷藏食品中的行为，便于进行更准确的风险预测和防范。

研究发现，微生物在低温作用下会产生冷应激反应，生成一系列的抗低温蛋白，称为冷激蛋白。细菌冷激蛋白是一类包含核酸结合冷休克结构域的高度保守的小分子蛋白（～7.4ku），可以作为分子伴侣与单链DNA或单链RNA结合，阻止DNA或RNA在低温下形成二级结构，从而促进转录和翻译。此外，冷激蛋白还参与细菌的多个生理生化过程，如：细胞膜的流动性，细菌正常生长与分化，营养胁迫，细菌的毒力等。冷激蛋白对细菌在低温时恢复生长和发挥细胞各种功能是非常重要的，是解析微生物低温适应机制的关键蛋白。然而，目前关于腐败希瓦氏菌冷激蛋白的研究鲜有报道。

细菌通常具有多个冷激蛋白，且冷激蛋白的作用规律十分复杂，并非所有冷激蛋白都受低温诱导表达。通过对NCBＩ数据库中腐败希瓦氏菌模式菌株的全基因组序列检索，发现腐败希瓦氏菌中存在3个典型冷激蛋白，目前尚未发现有关其主要冷激蛋白及相关功能的研究。本文以水产品的腐败希瓦氏菌为研究对象，通过PCR扩增获得水产品腐败希瓦氏菌的3个冷激蛋白基因序列，在此基础上通过生物信息学分析腐败希瓦氏菌冷激蛋白的理化性质、结构和功能特性等，旨在为冷激蛋白在腐败希瓦氏菌低温适应过程中的功能研究，以及对水产品中腐败希瓦氏菌的抑制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腐败希瓦氏菌为本实验室自腐败的冷藏大菱鲆中分离所得，于-80℃保藏。聚合酶链式反应（Polemerasechainreaction，PCR）引物委托生工生物工程（上海）技术服务有限公司合成

EasyTaqRDNAPolymerase，北京全是金生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、GeneRed核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司；Biowest琼脂糖、LB营养琼脂、LB营养肉汤，青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

防蒸发梯度PCR，美国Eppendrof公司；凝胶电泳及配套设备，美国Bio-Bad公司；微量冷冻离心机，美国Thermo公司。

1.3 菌种鉴定及冷激蛋白基因的克隆与测序

活化本实验室保藏的腐败希瓦氏菌，按照基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取基因组DNA，利用细菌16SrRNA基因通用引物27F和1492R进行PCR扩增，获得腐败希瓦氏菌的16SrRNA基因（表1）。采用NCBＩ检索近缘腐败希瓦氏菌菌株基因组信息（GenBank：CP002457.1），依据注释冷激蛋白基因及其上、下游序列，设计引物（表1），进行冷激蛋白的Csp1589，Csp1376和Csp2252基因的扩增。PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，Tm℃30s（详见表1），72℃45s，循环30次。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工测序。

1.4 系统发生树的构建

自NCBＩ数据库获得大肠杆菌（NC_000913.3）的9个冷激蛋白（CspA～Ｉ），以FASTAfile形式保存。通过软件ClustalX对测序所得腐败希瓦氏菌冷激蛋白和大肠杆菌的冷激蛋白进行序列比对，并用Mega7.0中的邻接法（Neighbor-jioningmethod，NＪ）为其构建系统发生树，步长值（Bootstrapvalues）为1000。

1.5 冷激蛋白的理化性质及结构域的预测

ExPASy网站中的一个工具ProtParam来预测腐败希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，用PSORTwwwServer中的PSORTPrediction工具预测冷激蛋白细胞定位，用TMHMMServer2.0预测冷激蛋白跨膜区域，用SignalＩP5.0在线预测冷激蛋白信号肽，用SMART预测冷激蛋白结构域的构成及其功能，用在线软件NCBＩConservedDomainSearch进行其氨基酸保守序列分析。

1.6 结构预测与模型质量评估

使用PSＩPRED预测腐败希瓦氏菌冷激蛋白的二级结构。将腐败希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到SWＩSS-MODEL网站进行三级结构的预测。将构建的蛋白三级模型用PROCHECK和Ｖerify3D进行质量评估。PROCHECK和Ｖerify3D是SAＶESv5.0中的结构评估服务。

1.7 互作蛋白及配体结合位点的预测

用STRＩNG工具确定在活体内与腐败希瓦氏菌冷激蛋白存在相互作用的蛋白。这种相互作用既包括蛋白质之间直接的物理相互作用，也包括蛋白质之间间接的功能相关性。将从SWＩSS-MODEL得到的模型文件输入COACH，以预测腐败希瓦氏菌冷激蛋白潜在的配体结合位点。

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