水产品腐败希瓦氏菌冷激蛋白的结构与功能分析（二）

2 结果与分析

2.1 冷激蛋白基因的水产克隆

通过16S测序结果的比对分析确定该菌为腐败希瓦氏菌。以这株水产品腐败希瓦氏菌的品腐基因组DNA为模板，用相应引物对冷激蛋白基因进行PCR扩增，败希白然后用2%的瓦氏琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图1所示。菌冷激蛋结构PCR扩增产物的分析长度在500bp左右，与预期的水产产物大小相符。将PCR产物送至上海生工测序，品腐并将测序序列用ORFFinder软件和Blast分析。败希白使用ORFFinder软件的瓦氏结果表明，克隆的菌冷激蛋结构基因片段都有完整的开放阅读框（ORF），3个冷激蛋白基因Csp1589，分析Csp1376和Csp2252的水产ORF长度分别为210，210，品腐207bp，败希白起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，分别编码69，69，68个氨基酸。Blast结果表明，水产品腐败希瓦氏菌的3个冷激蛋白基因与腐败希瓦氏菌模式菌株的3个冷激蛋白基因的序列相似性均达100%，说明冷激蛋白高度保守。

2.2 系统发生树的构建

使用MEGA7.0软件构建腐败希瓦氏菌和大肠杆菌的冷激蛋白的系统发生树，结果如图2所示。水产品腐败希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp1589和Csp1376与大肠杆菌的冷激蛋白基因CspA聚类在同一类群，表明它们之间的有较高的相似性和较近的亲缘关系。大肠杆菌CspA为主要的冷诱导蛋白，低温下大量表达。初步推测Csp1589和Csp1376在腐败希瓦氏菌对低温胁迫的适应中起关键作用。腐败希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252与大肠杆菌的冷激蛋白基因CspD位于同一分枝，大肠杆菌CspD在营养缺乏时大量表达并能结合单链DNA，从而抑制染色体的复制，因此腐败希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252可能与细胞生长分化有关。

2.3 冷激蛋白的理化特点

利用ProtParam预测腐败希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，结果见表2。预测的腐败希瓦氏菌冷激蛋白是由68～69个氨基酸残基构成，分子质量在7.4ku左右的小分子蛋白，且其带负电荷的氨基酸的量大于带正电荷氨基酸的量，即酸性氨基酸的量大于碱性氨基酸的量，PＩ小于7，说明这些蛋白质都是酸性蛋白质，符合CSPs的特点。蛋白质的总平均亲水性为负数，说明测定的蛋白皆为亲水性蛋白。由不稳定系数可知，除Csp2252外，蛋白质在体外的稳定性都较好，在大肠杆菌体内的半衰期大于10h。PSORT预测腐败希瓦氏菌冷激蛋白皆定位于细胞质。TMHMM预测结果显示腐败希瓦氏菌冷激蛋白均不存在α螺旋跨膜，是非跨膜蛋白。SignalＩP预测结果表明腐败希瓦氏菌冷激蛋白不存在信号肽，不能分泌到胞外。推测腐败希瓦氏菌的3个冷激蛋白均为非分泌型、非跨膜蛋白，冷激蛋白在腐败希瓦氏菌细胞质中合成后不进行蛋白转运，而是保留在细胞基质中发挥作用。

2.4 冷激蛋白的氨基酸保守序列及结构域分析

将腐败希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交至CDservice，检测结果显示：腐败希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589、Csp1376和Csp2252都具有DNA结合位点和RNA结合基序，且同属于类S1总科。类S1总科是一类包含与核糖体蛋白S1的RNA结合结构域相似的结构域的蛋白合集。这种结构最初在S1核糖体蛋白中被发现，目前已在多种RNA相关蛋白中被发现

SMART预测结果表明：腐败希瓦氏菌的3个冷激蛋白都包含冷休克结构域（Coldshockdomain，CSD），冷休克结构域属于类S1总科这个超级家族，且其从原核生物到高等真核生物高度保守，具有RNA分子伴侣功能。包含冷休克结构域的蛋白可以参与多种细胞生理生化过程，包括对低温的适应、营养胁迫、细胞生长和发育过程等。此外，由图3可知腐败希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589和Csp1376属于保守蛋白结构域家族CspC，是冷诱导蛋白，因此推测Csp1589和Csp1376与细菌对低温的适应性有关；而腐败希瓦氏菌Csp2252不属于CspC家族，其可能参与其它的细胞过程，这个结果与上述系统发生树的结果一致。

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