滚环扩增技术在食品安全检测中的研究进展（一）

食品安全一直受到广泛关注，滚环在实现食品中污染物准确检出的扩增前提下，快速方便的技术检测进展检测方式对食品安全的维持具有重要现实意义。滚环扩增技术(rolling circle amplification，食品 RCA)发展于20世纪90年代中期，安全是研究一种简单高效的体外核酸扩增技术，可在等温的滚环条件下快速扩增出由模板互补序列串联而得的长单链DNA。由于其引物易于标记固定和其模板设计多样性，扩增RCA应用于生物传感器中以及在提高传感器的技术检测进展检测灵敏度方面具备显著优势，因此被广泛应用于医疗诊断、食品环境监测以及食品安全等生物技术领域的安全研究中。本文综述了近几年RCA技术在食源性致病微生物、研究生物毒素、滚环农药兽药残留、扩增重金属等食品安全危害因子检测中的技术检测进展研究与应用进展，并展望了该技术在食品安全检测领域的发展方向。

引言

食品在生产加工的各个环节中都可能受到污染物的影响，长期摄入有安全隐患的食物会对人体健康产生不利影响。将食品中有毒有害污染物准确、快速、便捷地检出是科学有效地处理被污染食品的必要前提。核酸的体外扩增经过30多年的发展，已成为生命科学发展中一种不可或缺的重要技术。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是目前广泛应用的核酸体外扩增方法，但有依赖热循环步骤，可能会对某些重要生物分子产生破坏并且不利于实验室外实施。发展于20世纪90年代初的等温扩增技术可有效地实现核酸序列的快速积累，这类扩增技术根据第一步反应的特征，可被分为两大类：一类依赖于特异性引物延伸，包括环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依赖核酸序列扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)和依赖解旋酶扩增技术(helicase-dependent amplification，HAD)等；另一类是依赖于限制性内切酶，包括链置换扩增技术(strand displacement amplification，SDA)、切口酶扩增反应(nicking enzyme amplification，NEAR)以及切刻内切酶介导扩增技术(nicking enzyme mediated amplification，NEMA)等。其中RCA具有多项实用性能。首先，RCA产物由大量的具有高度可操作性的重复序列组成，扩增模板的多样设计可以实现多种应用目的，例如扩增核酸适配体、DNA模拟酶等功能核酸以及信号探针互补位点、限制性酶位点等。

另外，通过引物序列的修饰或者设计，可将RCA扩增产物直接固定于试条纸、微孔板、微流控芯片以及纳米颗粒等载体上，或者连接在核酸适配体、蛋白质等生物大分子上，这使RCA可灵活地与其他分离检测技术相结合。RCA技术在原位检测、微量物质测定、核酸诊断、单碱基多态性和药物研发等研究和分子诊断中有大量的相关研究报道并已有商业化产品出现。例如，上海易色医疗生产的“一步法恒温支原体检测试剂盒”其灵敏度高于普通PCR(30 cycles)80倍；华大基因通过使用美国Complete Genomics公司基于RCA开发的DNA纳米球基因测序技术，发布了桌面化测序系统BGISEQ-500，其基因组检测精度可达99.99%。图1对1995年以来每年发表的RCA相关文献数量进行了统计，2014年以来，RCA相关文献总量以每年200余篇的数量增加，表明了RCA技术的应用研究潜力和科学界对其的持续关注。目前，已有文献对RCA在医疗诊断、生物检测等领域进行了回顾，但未见其在食品安全方面应用的综述。因此，本文从RCA技术的原理和特点出发，重点归纳总结了近年来RCA技术在食品安全检测中的应用，系统梳理了其研究应用阶段性成果，以期拓宽该技术在食品安全隐患的快速筛查的应用发展。

1 RCA技术简介

1.1 RCA技术原理

RCA技术是对自然界中的某些转座子、质粒和病毒基因组的滚环复制的模拟而提出的。20世纪90年代中期，美国卡内基研究所的FIRE团队以及斯坦福大学的Kool团队先后描述了RCA。一般地，RCA可分为模板的连接成环和滚环扩增两部分。以常用的锁式探针模板(padlock probe，PLP)为例，PLP长度在100 bp以内，主要由两部分组成：(1)与引物反向互补的5'-磷酸化检测臂(T1)和3'-检测臂(T2)；(2)功能区域Zip，位于T1和T2之间，为RCA产物中的功能性序列提供模板。如图2a所示，在连接成环时，退火后的PLP与初始引物杂交，T1与T2相邻而形成的裂口在DNA连接酶的作用下闭合生成环状DNA模板。扩增步骤由具有连置换性的DNA聚合酶介导，图2b展示了经典的线性RCA(linear rolling circle amplification，LRCA)的扩增过程，在恒定温度下，DNA聚合酶将d NTPs添加到扩增引物5'端。当产物链在模板上延伸一周后，由于酶的链置换性，已扩增出的产物链的脱氧核糖核苷酸依次从模板上被置换，以进行下一个核苷酸的延伸。RCA的扩增过程如同拉出一卷卷尺，因此最终的RCA扩增产物是一个由含数百至数千个重复序列单体串联而组成的长ss DNA。

1.2 RCA技术特点

RCA具有高度灵敏性和特异性。在一个靶标分子对应一个引物的RCA生物传感器中，理论上可以实现1个拷贝的灵敏度。RCA反应条件温和，仪器简单，在常见的恒温仪器(如水浴、恒温培养箱)中即可进行扩增。RCA扩增的最适温度接近生理温度，温和的反应条件使RCA甚至可以在生物体中进行。RCA具有高效的扩增能力和信号放大能力。研究发现，Phi29 DNA聚合酶参与的LRCA能够产生长达105个碱基长度的扩增产物；使用2个扩增引物的超支化滚环扩增(hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)可在90 min内产生109的信号放大效果。为进一步实现RCA的信号放大，使用多个扩增引物的多引物RCA(multiple primers rolling circle amplification，MRCA)已在近年被应用。而在已报道的应用中，基于RCA信号放大的生物传感器通常可对pmol/L乃至amol/L级浓度的靶标物进行检测。另一方面，不同于PCR对低丰度被检核酸的扩增，RCA扩增的是靶向设计的核酸序列，设计的模板多样性决定了扩增模式和扩增产物的多样性，因此，RCA应用于传感器中可实现多种信号形式的放大。

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