山西老陈醋大曲细菌群落结构及多样性研究（一）

大曲是山西山西酒、醋酿造中重要的老陈落结发酵剂，在山西酒、曲细醋的菌群究发酵过程中起着非常重要的作用，直接影响产品质量和产量。构及大曲中的多样微生物利用原料底物生成大量不同种类的香味物质或香味前体物。再经过微生物的性研转化及工序传递，赋予成品酒、山西醋丰富的老陈落结滋味和良好的香气，构成传统山西酒、曲细醋特有的菌群究风味。

大曲中的构及微生物种群主要包括霉菌、酵母菌和细菌3大类。多样霉菌是性研大曲中最主要的菌群，其代谢产生丰富的山西淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系，用于分解淀粉和蛋白质原料产生多种有机酸、氨基酸、酯类等风味物质。酵母菌不仅利用糖生成大量乙醇和其它醇类物质。同时还生成乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯等多种酯类香气物质。大曲中的细菌则主要包括芽孢菌、乳酸菌和少量醋酸菌，众多种类的细菌大大补充并丰富了霉菌的酶系，是产生有机酸、酯类、酮类、醛类等风味物质和酚、黄酮、乙偶姻等功能活性物质的主要贡献者。

近年来。一些学者对山西老陈醋大曲中的微生物进行了分离。武晋海等采用传统分离手段从陈醋大曲中分离到乳酸菌、芽孢菌和醋酸菌，并且发现醋酸菌主要分布在大曲表面。乳酸菌和芽孢菌则主要分布在大区内部。冯峰采用传统分离手段结合PCR-DGGE技术研究大曲制备过程，发现前期的优势菌主要为戊糖片球菌、弯曲乳杆菌及融合魏斯氏菌，中期优势菌主要为欧文氏菌；后期则主要是芽孢杆菌。

本文采用高通量测序技术研究山西老陈醋酿造用大曲的细菌群落多样性，为揭示山西老陈醋微生物酿造机理，进一步优化大曲生产工艺，提高大曲质量奠定基础。该研究对于整个老陈醋行业的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在山西老陈醋东湖醋厂曲房中随机选取3块大曲置于灭菌的自封袋中，粉碎后混合保存于-80℃冰箱，备用。

1.2 主要试剂与设备

1.2.1 试剂

QIAquickPCRPurifieationKit，德国Qiagen公司；Tris-平衡酚，北京索莱宝科技有限公司；乙二胺四乙酸钠，天津市恒兴试剂有限公司。

1.2.2 设备

170-4406型水平电泳系统、Univer-sialHoodⅡ型凝胶成像系统、T100型PCR仪，美国Bio-Rad公司：5417R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；anoDrop2000型微量紫外-可见光分光光度计，美国ThermoScientmc公司。

1.3 宏基因组提取

参考聂志强等提取醋醅宏基因组的方法。提取的宏基因组用微量紫外一可见光分光光度计进行检测，0D260/280值维持在1.8～2.0范围内，表明宏基因组质量合格，可用于后续测序。

1.4 细菌DNA片段扩增及Miseq文库建立

以提取的宏基因组DNA为模板，加入细菌对应区域特异性引物(515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3’)、PCRMasterMix对细菌16SrD-NAV4区域进行扩增，扩增产物送至深圳华大基因进行文库构建及测序，测序平台为MiSeq2000。

1.5 系统发育进化树构建

将测序得到的操作分类单元(0TU)序列在美国国立生物技术信息中心采用基本局部比对搜索工具进行比对，搜索与目的0TU序列同源性最高的序列，经MEGA5.1软件构建系统发育进化树。

2 结果与讨论

2.1 山西老陈醋大曲细菌群落多样性分析

以山西老陈醋大曲宏基因组DNA为模板，利用特异性引物对细菌16SrDNAV4区域进行扩增，采用MiSeq2000测序平台进行测序。由表1可知，大曲样品获得36995个原始读长，滤除低质量的数据后，剩余35116个高质量读长。利用重叠关系将双末端测序得到的成对读长拼接成32230个序列，平均长度为(252±1)bp。拼接好的序列聚类为104个细菌OTU。最终，测序覆盖度达到99.93％，说明该测序量合理，可以进行下一步分析。

α-多样性通常用于分析单个样本中微生物数量的丰度及微生物种类的多样性，主要包括Chao指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数。通过Mothur(v1.31.2)软件计算微生物群落“一多样性指数期望值并用R(v3.1.1)软件绘制相应的细菌“一多样性稀释曲线。由图1可知，测序量在10000bD以内时，随着测序量增加，山西老陈醋大曲细菌的Chao指数和ACE指数急剧增加，当测序量增加到25000bp之后，Chao指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数都趋于平缓。

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