黑附球菌YP1分泌物的广谱抗霉菌活性和化学成分多样性分析（一）

霉菌是黑附化学营寄生或腐生方式生存的丝状真菌的通称，无明显的球菌子实体，这一点与同样营寄生或腐生方式生存但能形成大型子实体的分泌蘑菇类真菌相区别。霉菌有着极强的广谱繁殖能力，主要依靠形形色色的抗霉无性或有性孢子进行繁殖。霉菌的菌活滋生是导致果蔬、粮食和食品腐败变质的性和性分析主要原因之一，如在我国果蔬损失的成分25%～30%，粮食损失的多样10%是由霉菌滋生引起的，其数量庞大的黑附化学孢子是导致其快速传播繁殖的主要方式，部分霉菌还能产生霉菌毒素，球菌具有致癌性或其他毒性。分泌迄今为止，广谱人类已经开发了数十种的抗霉抗霉菌剂商品（保鲜剂、防腐剂）来应对上述问题，菌活它们在缓解果蔬、粮食和食品腐败变质方面发挥了无可替代的重要作用。然而，由于长期的使用，使得微生物的抗药性也在不断地增强，抗霉菌剂的抗菌效果正在不断下降甚至失效，因此只有不断地开发新的抗霉菌剂资源，多种抗霉菌剂轮换或组合使用，才能有效地应对抗药性，减少果蔬、粮食和食品腐败变质的发生。

从猕猴桃表皮分离到一株黑附球菌菌株YP1，其分泌物具有广谱的抗霉菌活性，对多孢子植物病原真菌也具有很好的抑制效果，在果蔬、食品的保鲜防腐以及植物病害的防治领域显示出很好的应用潜力。

一、材料与方法

1、材料

备筛真菌菌株：共70株，分离于不同种类的植物体，由本研究小组分离保存；测试霉菌：为本实验室分离保存；

植物病原菌：购于中国农业微生物菌种保藏中心；化学试剂：均为分析纯；真菌DNA提取试剂盒、ITS1和ITS4引物：购于北京三博远志公司。

2、仪器

岛津UFLC-20A高效液相色谱仪；美国应用生物系统公司TripleQTOF5600+质谱仪。

3、方法

（1）拮抗菌株的初筛

黑根霉孢子萌发抑制法：将70株待筛选真菌菌株的斜面菌种活化后，接入盛有100mL液体PDA的250mL锥形瓶中，28℃静置培养20d左右，弃菌丝，发酵液过滤，取9mL发酵液，加入1mL黑根霉孢子悬浮液（生理盐水配制），混匀，另取9mL经10倍稀释的液体PDA，加入1mL黑根霉孢子悬浮液混匀作为对照，待测样品与对照同时置于28℃静置培养6h，悬滴法制片，于显微镜下统计孢子萌发率，通常以芽管长度超过孢子直径的一半作为萌发标准。

（2）拮抗菌株YP1的鉴定

使用真菌DNA提取试剂盒提取YP1菌株的总DNA，以总DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物对YP1菌株的全长ITS序列进行PCR扩增。扩增产物由北京三博远志公司完成测序。将获得的ITS序列送入NCBI官方网站，使用BLAST程序进行在线比对，结合形态学特征确认YP1菌株的最终分类学地位。

（3）拮抗菌株YP1外分泌物的发酵制备

将YP1菌株斜面菌种活化后，接入盛有100mL液体PDA的250mL锥形瓶中，10瓶共1000mL培养液，28℃静置培养20d左右，弃菌丝，发酵液过滤后合并，用HCl调pH至4.5，1/4体积乙酸乙酯萃取2遍，发酵液中橙黄色物质全部转入乙酸乙酯中，合并乙酸乙酯相，用旋转蒸发仪减压浓缩后，倒入广口皿中用吹风机吹干，得橙黄色胶状固体，称量计算产量。取部分固体进行简单的溶解性和光热稳定性分析。

（4）拮抗菌株YP1外分泌物对各种霉菌的拮抗效果分析

①对霉菌孢子萌发的影响

准确称量200mg分泌物固体，将其溶解于稀Na2CO3溶液中，用稀盐酸将溶液的pH调至7.5作为母液备用，母液终体积为50mL，终浓度为4g/L。取上述分泌物母液适量，加入到适量体积液体PDA中，使液体PDA中分泌物终浓度达到200mg/L，以不加分泌物的液体PDA作为对照，两种培养基分装编号。将不同霉菌的孢子悬浮液一式两份分别加入到上述两种培养基中，混匀，于28℃静置培养6h，悬滴法制片，于显微镜下统计孢子萌发率。

②对霉菌平板生长的影响

将固体PDA培养基熔化，冷却至50～60℃时，将上述分泌物母液通过无菌过滤器加入到PDA培养基中，使培养基中分泌物终浓度达到200mg/L，充分混匀后倒平板，将各种供试霉菌菌饼（5mm）分别接入上述已经混有分泌物的PDA平板中央，对照PDA平板不加分泌物，接种霉菌菌饼后作为对照，置于28℃条件下培养，由于不同霉菌生长速度不同，每种霉菌在对照平板接近长满时即停止培养，拍照留底。

（5）拮抗菌株YP1外分泌物的化学组成分析

将拮抗菌株YP1外分泌物复溶于乙酸乙酯（添加0.1%体积的浓盐酸酸化）中，使其浓度达到0.2mg/mL，取5μL上样于高压液相-质谱联用仪，对其化学成分进行分离和鉴定，高压液相采用XDB-C18柱，甲醇（0.1%甲酸+5mM乙酸铵）作洗脱剂，流速0.2mL/min，质谱仪选用ESI电离源，扫描范围：50～2000m/z。

二、结果与分析

1、拮抗菌株的初筛

采用黑根霉孢子萌发抑制法从70个真菌菌株中初步筛选到一株对黑根霉的孢子萌发具有强烈抑制效果的真菌菌株YP1，其发酵滤液处理黑根霉孢子，孢子萌发率为0，而对照萌发率为93%，依据如下公式计算抑制率为100%。

孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率–处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率2、拮抗菌株YP1的鉴定以真菌DNA提取试剂盒提取到的YP1菌株的总DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物，通过PCR扩增获得了YP1接近全长的ITS序列，测序后送入NCBI官方网站，使用BLAST程序进行在线比对，结果显示其与附球孢菌属的黑附球菌具有最高的相似性（99%），同时YP1菌株的形态和生理特征与王宇等和Fávaro等对黑附球菌的描述一致，因此将其鉴定为黑附球菌。

在PDA平板上，YP1菌落平展，菌丝体大部分埋生，初期仅表面为橙黄色，后期整个菌落都变为橙黄色乃至棕黄色，培养基的颜色也由无色变为橙黄色至后期为深棕黄色。分生孢子产生较少，不易被观察，单生，顶生，球形或梨形，深褐色。

3、拮抗菌株YP1外分泌物的发酵制备及其溶解性、稳定性分析

YP1菌株在液体发酵过程中可向PDA培养基中分泌橙黄色物质，用盐酸调整发酵液pH4.5，经乙酸乙酯萃取、减压浓缩、吹干，得橙黄色胶状固体，产量为463mg/L（静置培养20d产量），分泌物易溶于极性有机溶剂，在水中的溶解性随着pH的升高而迅速增强，pH5以下难溶于水。分泌物水液对紫外线、强烈日光或120℃以上温度敏感，处理后褪色成为无色物质，在100℃以下温度时比较稳定，干燥固体则不受前述因素影响，表现稳定。

4、拮抗菌株YP1外分泌物对各种霉菌的拮抗效果分析

以不掺分泌物的液体PDA为对照，通过分泌物掺入和孢子悬浮培养，观察不同霉菌孢子的萌发情况，计算掺入分泌物对霉菌孢子萌发的抑制效果（表1）。

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