常压室温等离子体诱变技术选育曲霉型豆豉发酵菌种研究（一）

曲霉型豆豉的常压生产可以追溯至战国时代，在中国有着悠久的室温术选历史。传统曲霉型豆豉采用自然接种制曲，等离豆豉曲醅添加辅料后熟而成，体诱具有营养丰富、变技风味独特的育曲研究特点及保健功效。米曲霉作为曲霉型豆豉发酵的霉型优势微生物，其酶系丰富，发酵可在豆豉制曲阶段积累多种酶类，菌种其中的常压蛋白酶系（酸性、中性、室温术选碱性）尤为重要，等离豆豉对豆豉的体诱品质起到决定性作用。而在豆豉制曲过程中，变技米曲霉主要产中性蛋白酶，育曲研究其活性的高低决定了豆豉发酵成熟的周期和质量，此酶可将大豆蛋白降解为多肽、游离氨基酸等，对豆豉的营养及风味形成起到重大作用。

在工业化生产的背景下，采用纯种发酵对我国豆豉企业标准化生产具有重要意义。而优良的菌种除了产蛋白酶等酶系能力强，还应该具备生长速率快、产孢子能力强等特点，产孢子能力强的菌种更容易成为发酵过程中的优势菌种，抑制其它菌种的生长和繁殖，减少杂菌污染，缩短发酵周期，提高生产效率。但天然菌株产酶能力较差，难以适应工业化生产，因此科研工作者进行了大量的菌种改良工作。夏杨振兴通过对米曲霉中性蛋白酶I基因进行定点突变，对构建好的毕赤酵母Gsll5基因工程菌进行甲醇诱导，发现增加糖基化位点后的突变酶活力较野生型提高了11.5％

然而基因工程菌株在实际的生产应用受到很大的限制，目前在米曲霉的育种方面依然采用的是经典的物理化学诱变，而清华大学研发的常压室温等离子体诱变技术作为一种新型的诱变技术，相比于传统的诱变手段，其具有基因损伤强度高、突变范围广、安全便捷的优势，显著提升了菌株的突变率，近年来广泛应用于微生物育种领域。该技术的诱变原理基于大气压射频辉光放电产生的等离子体（ARTP），等离子体产生的大量活性粒子与微生物细胞及周围基质作用，产生大量的活性氧、活性氮自由基，并改变细胞膜的通透性，这些活性粒子和氧化自由基进入细胞，与DNA、蛋白质等生物大分子作用造成DNA的直接和间接损伤，引起细胞的SOS等多种保守和非保守的修复机制，从而引起高效突变。

曲霉型豆豉对感官品质要求严格，对其组织形态要求颗粒完整、松散成型，因而其生产必须由整粒大豆经蒸煮，之后发酵制成。由于物料的形态缺陷导致固态发酵过程中与微生物接触空间有限及传质不均匀，进而导致了曲霉型豆豉了曲醅蛋白酶活力较低。因此本文利用ARTP诱变技术选育高产中性蛋白酶活力米曲霉菌株，并用整粒大豆制作复筛培养基进行酶活验证，以期提升曲醅的中性蛋白酶活力，为曲霉型豆豉纯种发酵奠定一定的理论基础。

一、材料和方法

1、菌株

米曲霉（Aspergillus oryzae）NCU一110：从日本酱油酿造用菌粉中分离而来，经擎科生物测序，测序结果在NCBI网站进行BLAST比对后，其同源性与Aspergillus oryzae isolate F8160（Accessionnumber：MN429212.1）高达99.64％，鉴定为米曲霉，该菌株具有蛋白酶系完整，以产中性蛋白酶为主的特点。目前由南昌大学中德食品工程中心保藏。

2、试剂与仪器

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、酪蛋白、三氯乙酸、福林酚试剂、酪氨酸、浓盐酸（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；TGL一16B型高速离心机：美国赛默飞世尔科技公司；

SP—756P紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；HWS—250恒温恒湿培养箱：上海新苗实验仪器有限公司。

3、培养基

（1）菌种活化及保藏培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）；

（2）初筛培养基：干酪素4.009，磷酸二氢钾0.369，磷酸氢二钠1.079，氯化锌0.049，氯化钙0.0029，硫酸镁0.59，氯化钠0.169，硫酸亚铁0.0029，胰蛋白胨0.03～0.059，琼脂159，蒸馏水定容为lL，12l℃灭菌30min；

（3）复筛、制曲培养基：选取1509优质东北黄豆，清洗后用三倍体积的自来水于35℃浸泡3h，沥干后，121℃灭菌30min；

（4）种曲培养基：麸皮、豆粕、水质量比例为：80∶20∶80，500mL三角瓶装量料509，水40mL，自然pH，121℃灭菌30min；

（5）察氏培养基：硝酸钠3.09，磷酸氢二钾1.09，氯化钾0.59，硫酸镁0.59，硫酸亚铁0.019，蔗糖209，蒸馏水1L，将上述药品按顺序溶解后，加入209琼脂加热溶化，分装后121℃灭菌30min。

4、 ARTP诱变

（1）米曲霉孢子悬浮液制备

取活化好的米曲霉NCU一110试管斜面，用无菌生理盐水冲洗即得孢子悬液，取样进行血球计数板计数，将孢子悬液稀释至106CFU/mL，备用。

（2） ARTP诱变条件的确定

采用氦气为工作气体，使载片与等离子体发生器射流出口间距约2mm，功率为120W，气流量10L/min，对10μL孢子悬液进行诱变处理，设置诱变时间为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9min。梯度稀释诱变后孢子悬液分别为4.0×10⁴CFU/mL、4.0×10³CFU/mL和4.0×10²CFU/mL，各取100μL涂布于初筛培养皿，30℃避光恒温培养3d，计算致死率，绘制致死曲线图。

致死率=（对照菌落数一诱变平板菌落数）/对照菌落数×100％

5、高产中性蛋白酶活力菌株筛选

（1） 初筛方法

选择最佳诱变时间下的孢子悬浮液，适当稀释（4.0×10²CFU/mL）后涂布于初筛培养基，30℃培养72h，观察各个平皿中初筛菌株的透明圈和菌落大小，挑取菌落较大并且透明圈明显的60株米曲霉（编号NCU—A1-A60）单菌落接种于PDA试管斜面，于30℃培养3～5d，待试管中突变米曲霉菌丝布满黄绿色孢子，将60株米曲霉与原始菌株在初筛培养基上进行点种实验，计算K值并取K值较大的18株突变菌株进行下一步复筛实验。

K=透明圈直径／菌落直径，K值代表了菌株产蛋白酶的能力，可以用来判断突变株产生蛋白酶活力的大小。

（2）浅盘制曲复筛高产中性蛋白酶活力突变株

将K值较大的18株初筛菌株活化，制备孢子悬液并稀释至107CFU/mL。根据曲霉型豆豉浅盘制曲工艺，按照1.0％的接种量，前期发酵温度控制在30～34℃，制曲至第18～24h，豆粒表面布满白色菌丝，进行第一次翻曲；当曲醅出现嫩黄孢子时，进行第二次翻曲，温度控制在28～32℃。培养至72h取样，采用SB/T 10317—1999中的福林酚法测定各菌株曲醅中性蛋白酶活力。

6、突变株遗传稳定性验证实验

将复筛得到的数株中性蛋白酶活力显著提高的突变株和原始菌株在PDA试管斜面上30℃连续传代9次，对上述菌株第1～9代豆豉曲醅的中性蛋白酶活力进行测定，检测复筛菌株的遗传稳定性。

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