荧光光谱法和磷光光谱法（五）

八、荧光实验

（一）芘的光谱光谱荧光光谱测定

1、实验目的法和法

(1)通过在不同溶液条件下测定芘的荧光光谱，了解溶剂极性和溶质浓度对荧光光谱的磷光影响。

(2)通过实验了解常用荧光探针芘的荧光基本性质，了解荧光分析法的光谱光谱定性定量分析应用。

2、法和法实验原理

一般情况下，磷光与基态分子相比，荧光激发态分子与溶剂等周围介质的光谱光谱相互作用较强。因此，法和法荧光光谱比紫外一可见吸收光谱更容易反映分子间的磷光相互作用。其代表物质就是荧光芘及其诱导体，这类物质作为胶束、光谱光谱表面活性剂胶囊等微环境极性或黏度探针在分子水平进行生物化学研究中应用广泛。法和法

图15.12是单体芘的荧光光谱，在370-400nm有5个振动精细峰，各峰的强度比随芘分子的周围环境极性变化而变化。尤其是第Ⅲ个峰和第1个峰的峰强度比在极性大的环境中大，能敏锐地反映微环境极性变化。当溶液中芘的浓度增大时，激发态芘与基态芘形成激基二聚体，会在480nm处产生芘激基二聚体的荧光发射峰。激基二聚体的形成过程中扩散步骤是慢反应，决定反应速率。因此溶剂黏度越低越容易生成激基二聚体。另一方面，激基二聚体生成后，激发态单体的浓度降低，单体荧光峰强也随之降低。因此，可以认为产生激基二聚体的原因是单体荧光的浓度猝灭所致。

在观测浓度为数毫摩尔每升的浓溶液中的激基二聚体发光时，除了生成激基二聚体导致的浓度猝灭外，由于激发光内部的屏蔽作用或荧光的再吸收可能使单体峰处的荧光强度与芘溶液浓度不成正比，尤其是单体的第一个荧光峰离其吸收光谱峰最近，最容易受到溶液对荧光的再吸收的影响。

3、仪器与试剂

仪器：荧光分光光度计，lcm荧光池，容量瓶(1L 1个，500mL 2个，l00mL2个，50mL 1个，25mL 6个)，移液管(1mL 3个)，刻度移液管(10mL 2个)。

试剂：芘，乙醇，乙腈，环己烷。

4、实验内容与步骤

(1)不同溶剂中l×10^-6mol／L芘溶液的配制：准确称取10 mg芘溶解于适量乙醇中，用容量瓶，加乙醇定容至100mL。用移液管移取该溶液1mL于容量瓶中加乙醇定容至500mL，得到1×10^-6mol／L芘-乙醇溶液。同样，将溶剂换为乙腈，配制1×10^-6m01／L芘-乙睛溶液。注意，更换荧光池中的溶液时，一定要用测定溶液多次重复冲洗荧光池。

(2)不同浓度芘-环己烷溶液的配制：准确称取O.10g芘溶解于适量环己烷中，用容量瓶定容至50mL，得到1×10^-2mol／L芘-环己烷溶液。分别移取此溶液2．5，6．3，12．5mL至25mL容量瓶中，加环己烷定容，得到1×10^-3，2.5×10^-3，5×10^-3mol/L芘-环己烷溶液。再取1×10^-3mol／L溶液1mL，用环己烷稀释至1L容量瓶中，定容，得到1×10^-6mol／L芘-环己烷溶液。取此1×10^-6mol／L芘溶液2.5，6.3，12.5mL，加环己烷定容至25mL容量瓶中，得到1×10^-7，2.5×10^-7，5×10^-7m01／L芘-环己烷溶液。

(3)荧光分光光度计的激发波长设为330nm，激发狭缝设在10nm以下，发射狭缝设在1.5nm以下，发射光谱测定范围设在350～600nm。

(4)将1×10^-6mo1／L芘-环己烷溶液移入荧光池内至2/3体积，放入仪器样品室，依据其荧光强度值调节仪器的灵敏度、光电倍增管电压等参数，测定其荧光光谱。然后在同样仪器条件下，依次按如下顺序测定不同浓度的芘-环己烷溶液的荧光光谱：1×10^-7，2．5×10^-7，5×10^-7，1×10^-6，1×10^-3，2.5×10^-3，5×10^-3，1×10^-2mol／L。

(5)依据1×10^-6m01／L芘-乙醇溶液的荧光强度值重新调节仪器的灵敏度、光电倍增管电压等参数，测定其荧光光谱。同样测定1×10^-6m01／L芘-乙睛溶液的荧光光谱。

5、注意事项

荧光分析是高灵敏度分析方法，溶液浓度一般在1×10^-6mol／L量级，很稀。实验中应注意保持器皿洁净，溶剂纯度应为分析纯，实验用水需要使用二次重蒸水。应注意杂质荧光的影响。

6、数据处理

(1)由不同溶剂中1x10^-6m01／L芘溶液的荧光光谱，分别计算第三个峰和第一个峰的峰强度比。

(2)由1×10^-7，2.5×10^-7，5×10^-7，1×10-2mol／L芘-环己烷溶液的荧光光谱，以第一个峰的荧光强度对溶液浓度作图。另外，由1×10^-3，2.5×10^-3，5×10^-3，1×10^-2mol／L芘-环己烷溶液的荧光光谱，再以第一个峰的荧光强度对溶液浓度作图。

(3)将1×10^-3，2.5×10^-3，5×10^-3，1×10^-2mol／L芘-环己烷溶液的荧光光谱重叠打印于同一张图纸上。

九、利用8-羟基喹啉-5-磺酸的锌荧光光度定量分析及胶束增敏效应

1、实验目的

利用8-羟基喹啉-5-磺酸进行锌的荧光光度定量分析，并理解胶束增敏效应。

2、实验原理

8-羟基喹啉-5-磺酸(Qs)可与镁、锌、铬、铝、镓、铟等金属离子在水溶液中生成荧光性配合物。这些配合物在低介电常数的溶剂中荧光强度增大，其原因是配合物与极性溶剂相互作用减少了非辐射失活过程的几率。本实验利用8-羟基喹啉-5-磺酸进行锌的荧光光度定量分析，并观测配合物由于进入阳离子表面活性剂氯化癸基二甲基苯基铵胶束中而产生的荧光增敏效应(图15.13)。

参考资料：现代仪器分析实验与技术