表没食子儿茶素没食子酸酯稳定性研究（一）

表没食子儿茶素没食子酸酯，表没是食儿酸酯儿茶素中含量最高活性最强的成分，也是茶素绿茶利好人体健康的主要承担者。儿茶素的没食结构特征是B-环上有二个或三个羟基基团和A-环上的5，7-二羟基基团，稳定因此具有抗氧化活性。性研EGCG除上述两个环上的表没羟基外，还在D-环上带有三个羟基，食儿酸酯在四种主要的茶素儿茶素中，其抗氧化活性最强。没食EGCG不仅可以直接清除胞内活性氧/氮离子，稳定还能螯合几种具有强正电荷的性研金属离子；其可使铁离子失活，抑制超氧化物驱动的表没芬顿反应；抑制H₂O₂形成和脂质过氧化。因此，食儿酸酯大多研究认为EGCG对人体健康的茶素利好效应源于其卓越的抗氧化能力。

然而，由于EGCG特殊的化学结构特征，稳定性较差，可发生自动氧化和异构反应，根据所处条件(EGCG浓度、pH、温度和含氧景等)其反应取向不同。当EGCG自动氧化形成多聚物时，可能产生如H₂O₂一类的活性氧，表现出促氧化活性。有研究发现，50μmol/LEGCG在无细胞的McCoy’S5A培养基中120min，培养基中的H₂O₂达到峰值25μmol/L。用相同的条件处理HT-29细胞30min后培养体系中的H₂O₂水平达到最高水平10μmol/L，在活体中，也观察到了EGCG的促氧化效应，用高剂量的EGCG喂食小鼠，出现剂量依赖的肝脏毒性。但EGCG的促氧化效应在不同的细胞和动物模型中并没有得到一致的结论。Sheng等发现200μmolZL的H202能显著诱导正常人心脏成肌细胞H9c2凋亡，而EGCG可抑制H₂O₂介导的H9c2凋亡，用EGCG单独处理H9c2时并未观察到胞内外的H₂O₂水平的变化。

因此，本文解析EGCG氧化聚合的环境条件，及其稳定性变化对受试细胞氧化还原平衡的影响，为进一步探讨EGCG在细胞培养体系及活体中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人正常结肠上皮NCM460细胞购白中科院昆明动物所细胞库；EGCG粉末购白sigma公司；过氧化氢检测试剂盒(S0038)购白上海碧云天公司。

MCO-5AC培养箱SANYO；318C酶标仪上海三科仪器；NanoPhotometerN60分光光度计IMPLEN；VANOX-S显微镜0TⅣPUS。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂配制

1.2.1.1 EGCG溶液

0.15gEGCG粉末融人10mL的三蒸水中搅拌均匀配制成32mmol/L的EGCG溶液，在超净T作台利用0.2μm针头滤器进行无菌过滤。待实验丌始前将EGCG溶液储存液稀释至如表1所需浓度。

1.2.1.2 细胞培养基

RPMll640或DMEM培养液Gibco，含10％胎牛血清Gibco；0.1％双抗(10万单{ 立/mL)Gibco；1％L-谷氨酰胺(200mmol/L)Gibco。

1.2.1.3 其他

细胞磷酸缓冲液(PBS)Gibco；0.4％台盼蓝Solarbio，0.25％胰蛋白酶Gibco。

1.2.2 影响EGCG氧化聚合的环境因素分析

1.2.2.1 溶液环境对EGCG聚合的影响

实验选择了H₂O、RPMll640、DMEM(pH=7)三种溶液体系，分别加入不同浓度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培养箱恒温反应24h后，吸取三个重复的150μL溶液置于96孔板中，检测578nm的OD值，以确定溶液体系对EGCG氧化聚合的影响。

1.2.2.2 温度环境对EGCG聚合的影响

实验以RPMll640(pH=7)为溶液体系，分别加入不同浓度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培养箱和74℃的水浴锅中恒温反应24h后，吸取三个重复的150μL溶液置于96孔板中，检测578nm的OD值，以确定温度对EGCG氧化聚合的影响。

1.2.2.3 时间对EGCG聚合的影响

实验以RPMI1640(pH=7)为溶液体系，加入320μmol/L的EGCG，置于37℃培养箱恒温反应3、6、12、24h后，各组吸取三个重复的150μL溶液置于96孔板中，检测578nm的OD值，以确定时问对EGCG氧化聚合的影响。

1.2.2.4 pH对EGCG聚合的影响

实验选用RPMI1640和H20为两种溶液体系，分别设置不同的pH(pH=5和9)，加入不同浓度的EGCG(0、20、80、320μmol/L)，分别置于37℃培养箱中恒温处理24h后，各组吸取三个重复的150μL溶液置于96孔板中，检测578nm的OD值，以确定pH对EGCG氧化聚合的影响。

1.2.3 EGCG在培养系统中对NCM460细胞的胞内、外H₂0₂浓度影

响接种6个含NCM460的6孔培养板，待细胞贴壁生长后，更换含有不同浓度EGCG(0、20、40、80μmol/L)的RPMll640培养液，每个6孔板培养时间分别为l、2、3、6、12、24h，在对应的时间节点先取各孔上层培养液50μL，用于胞外H₂0₂浓度检测。之后，弁去含EGCG培养基，胰酶消化后用1mLRPMI1640培养基吹打混匀形成细胞悬液，计数，吸取5×105个细胞，用于胞内H₂0₂浓度检测。

1.2.4 H₂0₂浓度检测

按照过氧化氢检测试剂盒操作步骤，检测小同浓度EGCG处理各时间点的培养上清及细胞内H202浓度。

1.3 统计学分析

实验均重复三次，对数据进行整理归纳，利用SPSS17.0统计软件进行单凶素方差分析，采用GrahPadPrism5制图软件作图分析。

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