农药选择性多残留方法(四)

(2)高效液相色谱仪：包括：流动相传输系统(双泵梯度洗脱系统)、农药具40μL定量环的选择性多进样器、保护柱(直接与预填充的残留C₁₈柱连接)、柱温箱或柱加热器(保持柱恒温)、农药分析柱[25cm×4.6mm(内径)，选择性多填充十八碳硅烷键合的残留粒状颗粒(ODS，C₁₈)，农药如EconosphereC₁₈]、选择性多柱后光解、残留衍生单元[包括：用于光解的农药紫外灯，配备电源，选择性多17cm×9mm(外径)；Teflon光解灯套管，残留25’×0.5mm(内径)线圈，农药将Teflon管盘绕在灯上，选择性多一端与T形混合器相连，残留另一端与柱连接；用于OPA-MERC溶液的低流速泵，连接锥形线圈，在泵和0.5mm(内径)Tefton管问作为脉冲阻尼器，与T形混合器相连；T形混合器，不锈钢，0.25mm孔径，标准1/16”；反应线圈，10’×0.5mm延迟线圈，一端与T形混合器相连，另一端连接检测器]、荧光检测器。

3、测定条件：用单泵或双泵，以0.002mol/LNaH₂PO₄-甲醇(9∶1)为流动相，0.3mL/min洗柱过夜。流动相改为10％甲醇-水(高效液相色谱级)，1mL/min运行30min。如果使用几天后色谱基线出现漂移，重复此过程。

保持分析柱温35℃，用40％甲醇水1mL/min平衡系统，OPA-MERC溶液以0.2mL/min加入T形混合器，OPA-MERC溶液开始流动时，打开紫外灯，稳定检测器。

进检测溶液或标准溶液后，从40％甲醇一水到80％甲醇一水开始30min的线性梯度洗脱，检测器激发波长为340nm，发射波长为455nm。调节检测器灵敏度，使1.0μg/mL敌草隆溶液40μL的响应为记录仪或积分仪量程的50％。此条件下敌草隆的洗脱时间约为24min。

每天使用后，用80%甲醇一水冲洗色谱柱20min，色谱柱也可在此重要条件下储存。

三、苯并咪唑类杀菌剂的多残留分析

(一)方法原理与适用性

用甲醇提取，提取液酸化后，通过液液分配法转移到二氯甲烷中，然后将提取液碱化。分离残留，并用配有紫外和荧光检测器的反相离子对高效液相色谱法进行定量分析。

该方法适于蔬菜和水果中脲基甲酸盐、多菌灵(由于使用苯菌灵、多菌灵或甲基硫菌灵而得)和涕必灵的残留测定。紫外检测器对适用该方法的所有的残留农药都有响应，而荧光检测器仅对多菌灵和涕必灵有响应。采用已给的方法分析样品中的残留会将样品中的干扰物质与残留农药一并提取出来。将此方法变动以适用于咖啡豆的分析，但仅限于对多菌灵的分析。

该方法对于所测定的各种农药的定量限都是0.1mg/L。紫外检测器是非选择性的，易受作物的干扰，因此定量限可能受某种样品的影响。对于涕必灵，使用荧光检测器，在最大吸收波长条件下，该化合物的定量限可至0.01mg/L。

(二)标准溶液配制

分别用丙酮配制25μg/mL的脲基甲酸盐、多菌灵、涕必灵和甲基托布津的储备液(不用苯菌灵配制储备液，是因为该溶液静置过夜时，完全降解为多菌灵)。标准品溶液在丙酮和高效液相色谱仪(HPLC)流动相中稳定。

混标的配制：从已配好的储备液中，各取出1mL混合后，在30～40℃的微热下以氮气流挥发溶剂至干，然后加入4.0mL甲醇溶解，再加入6.0mL高效液相色谱离子对溶液，

混匀，得各种标准品的最终浓度均为2.5μg/mL。

(三)提取

称取50g已切碎的样品于500mL具塞锥形瓶中，加入100mL甲醇，在机械振荡器上振荡10min。如分析香蕉(整个或仅果肉部分)，则在机械振荡器上振荡之前，先用手用力将其摇匀。

用装有滤纸的布氏漏斗将上述溶液过滤至真空滤瓶中，然后用50mL甲醇冲洗锥形瓶和滤纸上的残渣。转移滤液于500mL分液漏斗中，加10mL1mol/L盐酸和100mL1％NaCl溶液，混匀，冷却。每次用100mL二氯甲烷剧烈振荡提取滤液两次，每次提取1min。将二氯甲烷层过约70g无水硫酸钠柱(脱水)，用圆底烧瓶收集柱流出液。甲醇水溶液层仍保存在分液漏斗中，留待以后提取用。用50mL二氯甲烷淋洗硫酸钠柱，并收集在圆底烧瓶中。用真空旋转蒸发器在≤30℃的水浴中，挥发圆底烧瓶中的二氯甲烷，至干。加入4mL甲醇溶解提取物，该提取物中含有脲基甲酸盐、甲基硫菌灵、涕必灵和多菌灵。

将分液漏斗中的甲醇水溶液层全部转移到烧杯中，用水冲洗分液漏斗两次，每次10mL，洗液倒入烧杯中。

用5mol/L和1mol/L的NaOH(如需要，可用1mol/L盐酸)调节烧杯中提取液的pH至7.5～8。在调节溶液的pH时，切勿使溶液呈强碱性。

再将烧杯中溶液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷激烈振荡提取两次，每次100mL，每次提取1min。

将二氯甲烷层过约70g无水硫酸钠柱，用圆底烧瓶接收柱淋出液(前面用于干燥二氯甲烷的无水硫酸钠柱可再次使用)。用50mL二氯甲烷淋洗硫酸钠柱，并收集在圆底烧瓶中。

在真空旋转蒸发器上，挥发二氯甲烷提取液至干，用4mL甲醇溶解提取物。至此，已将大部分的多菌灵和涕必灵提取出。

(四)净化

本方法目前没有可以参考的净化方法。

(五)测定

1、原理苯并咪唑类杀菌剂的残留采用离子对反相色谱进行分析。多菌灵和涕必灵在酸性流动相中被离子化与由癸烷基磺酸钠产生的带负电荷的反离子形成离子对，以控制高效液相色谱系统的选择性，并从样品提取物中的干扰物中分离出待分析物。根据反相色谱的原理，在该条件下的色谱柱中呈中性的甲基脲酸盐和甲基硫菌灵将不受流动相改变的影响。

紫外检测器和荧光检测器均对多菌灵和涕必灵有响应，紫外检测器还对甲基硫菌灵和脲基甲酸盐响应。

2、仪器

仪器包括：流动相输送系统(为恒流泵)、进样器(带有≥25μL定量环的自动样品进样阀)、色谱柱[25cm×4.6mm(内径)，与硅键合的C₁₈柱，粒径5μm，适于大多数碱性化合物的分析]、与色谱柱配套的保护柱(与硅键合C₁₈柱的填料相同)、柱温箱(可容纳保护柱和色谱柱)、可变波长紫外检测器或二极管阵列检测器(且装有约8μL的流通池)、记录仪(谱线记录仪或适于各种检测的计算积分仪)。

3、测定条件

(1)流动相：离子对溶液和甲醇以65∶35的比例混合(切勿用泵混合流动相，因为混合时的放热反应所产生的气泡使泵不能稳定地工作)。在使用前，要边用磁力搅拌子剧烈搅动溶液，边通人氦气进行脱气。

(2)离子对溶液：离子对溶液中含4.1mmol/L1-癸烷磺酸钠盐(纯度为98％)。移取7.0mL磷酸(85%)于200mL高效液相色谱纯的水中，在该溶液中加1.0g1-癸烷磺酸钠盐。再移取10.0mL三乙胺(99％)于溶液中，并用高效液相色谱纯的水稀释至1L。过＜1μm的微孔滤膜(溶液的pH应约为2.4)。

(3)甲醇：甲醇须经全玻璃蒸馏器蒸馏。

(4)水：水为高效液相色谱纯的水，市售或采用制备蒸馏水、去离子水的纯水装置制得。该水的电阻值务必＞12MΩ/cm。

(5)检测器的连接：将荧光检测器与紫外检测器串联在一起。设柱温箱温度为40℃，用流动相以1.5mL/min的流速平衡系统30min以上或直到所得4个分析物的保留时间是一个常量。

(6)色谱柱：如长时间(≥24h)不用，则用50％的甲醇-水溶液洗色谱柱；如短期内不用，则用低流速(0.10～0.2mL/min)的流动相清洗色谱柱以防止盐沉积。

为了去除柱中残留量高的样品组分，在50％的甲醇一水溶液洗色谱柱后，用甲醇洗色谱柱。在输人流动相之前，再用50％的甲醇-水溶液洗色谱柱。加入甲醇前，必须用水冲洗色谱柱中的流动相，以避免盐沉积可能会堵塞系统。

(7)紫外检测器紫外检测器吸收波长开始设为250nm，在淋洗完脲基甲酸盐后，将波长设为280nm，并将基线调至零起始线测定甲基硫菌灵、多菌灵和涕必灵。调整检测器和(或)记录仪的灵敏度，使每个标准品(62.5ng/25uL)响应均为满刻度的40％～70％。

(8)荧光检测器：荧光检测器的激发波长设为280nm(狭缝宽为20nm)，发射波长设为310nm(狭缝宽为10nm)。调整检测器、衰减和(或)记录仪的灵敏度，使62.5ng/25μL的多菌灵响应为满刻度的60％～80％，而在此条件下，62.5ng/25μL涕必灵的响应则为满刻度的40％～50％。

另外，还可使用可程序改变波长荧光检测器和可程序改变波长或二极管阵列紫外检测器，以在最佳波长条件下进行残留测定。

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