响应面法酶解藜麦蛋白制备α

二、面法酶解结果与分析

1、藜麦藜麦提取蛋白酶解制备多肽结果

（1）多肽含量标准曲线的蛋白绘制
 

由图1可得线性方程为，y=0.1687x—0.0119，制备相关系数为R²=0.9946。面法酶解式中：y为吸光度A；x为牛血清蛋白浓度，藜麦mg／mL。蛋白

（2）蛋白酶的制备筛选

由表3可知，4种酶酶解后的面法酶解多肽得率都超过了30％，对α-淀粉酶活性具有一定的藜麦抑制作用，说明4种酶对藜麦蛋白都具有明显的蛋白酶解效果，其中中性蛋白酶和胰蛋白酶的制备多肽得率超过50％，而碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解后的面法酶解抑制率较风味蛋白酶和中性蛋白酶高，蛋白酶解程度越大，藜麦多肽得率也越高，蛋白生成的低分子肽段就越多，具有抑制活性的肽段容易被降解导致抑制活性降低。考虑到两种因素，选择胰蛋白酶进行下一步的酶解试验。

（3）胰蛋白酶单因素酶解条件研究

酶解时间、酶解温度、pH、加酶量对α-淀粉酶活性抑制率和多肽得率作用效果见图2～图5。
 

①酶解时间对酶解效果的影响

由图2可知，随着酶解时间的延长，多肽得率逐渐升高，这说明在蛋白液浓度一定的条件下，酶解时间的延长使酶与蛋白质的作用时间越充分，蛋白质被水解的程度大，生成小分子片段的短肽越多，从而其多肽含量逐渐升高。在1～3h之间酶解速率逐渐增加，在酶解初期，蛋白液中残留的多糖、大分子蛋白会沉淀在烧杯底部，随着酶与底部大分子蛋白充分接触，酶解速率迅速增加。α-淀粉酶活性抑制率出现先升高后降低的趋势，在酶解时间为2h时，α-淀粉酶活性抑制率达到最大值27．1％，随着酶解的持续进行，之前酶解得到的α-淀粉酶抑制肽被酶解为更小分子的肽段，从而活性抑制率降低。考虑两种酶解试验结果，选择酶解时问2h为最佳。

②pH对酶解效果的影响

pH的改变影响了酶的最适反应条件，易使酶失活和降解，进而造成酶解反应的中止。由图3可知，多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率都出现了先升高后下降的趋势，在pH8．0时多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率都达到最高值，之后旷淀粉酶抑制率迅速减小，多肽得率趋于平缓并略有减小，由于过酸过碱的环境会使酶的活性部位遭到破坏或解离，pH对酶解效果至关重要。因此，选定胰蛋白酶的酶解pH为8.0进行酶解。
 

③酶解温度对酶解效果的影响

由图4可知，多肽得率呈现持续升高趋势，由于温度的升高增大了酶与蛋白分子的接触机会，酶的活性也随之增强，多肽得率逐渐升高，α-淀粉酶活性抑制率也随之升高，在50℃达到最大值26.8％，随后出现降低，温度超过60℃可能会直接使活性肽进一步解离，丧失抑制活性，从而使α-淀粉酶活性抑制率下降。因此，选择酶解温度在50℃左右。
 

④加酶量对酶解效果的影响

由图5可知，随着加酶量的增加，多肽得率逐渐上升，α-淀粉酶活性抑制率先上升后下降，增大加酶量使得酶与底物蛋白分子充分接触，一些沉淀在底部的大分子蛋白也随着被水解，而随之加酶量进一步增加，一些具有α-淀粉酶活性抑制的肽段也随之被水解为更小分子量的短肽，旷淀粉酶活性抑制率出现降低。当加酶量在0.5×10⁴U／g时，α-淀粉酶活性抑制达到最大值45.1％。因此，选择加酶量在0.5×10⁴U／79比较适宜。

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