致泻大肠埃希氏菌标准检验方法（二）

乳鼠灌胃试验检测ST：将被检菌种于Honda氏产毒肉汤内，致泻于36℃培养24h，大肠以3000r/min离心30min，埃希取上清液经薄膜滤器过滤，氏菌加热60⁰C30min，标准每毫升滤液内加入2％伊文斯蓝0.02mL，检验将此滤液用塑料小管注入1～4日龄的致泻乳鼠胃内O.1mL，同时接种3～4只，大肠禁食3～4h后用三氯甲烷麻醉，埃希取出全部肠管，氏菌称量肠管(包括积液)质量及剩余体重。标准肠管质量及剩余体重之比大于0.09为阳性，检验0.07～0.09为可疑。致泻

二、大肠结果分析判定

综合以上生化试验、埃希血清学试验、肠毒素试验作出报告。

三、培养基和试剂

(一)营养肉汤

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.4。

按上述成分混合，溶解后校正pH，分装三角瓶，每瓶225mL，121⁰C高压灭菌15min。

(二)肠道增菌肉汤

(三)麦康凯琼脂

蛋白胨17g，脲胨3g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，乳糖10g,0.01％结晶紫水溶液10mL,0.5％中性红水溶液5mL。

将蛋白胨、脲胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正至pH7．2。将琼脂加入于600mL蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121⁰C高压灭菌15min备用。

临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖。冷至50-55⁰C时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。

结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。

(四)伊红美蓝琼(EMB)

蛋白胨10g,乳糖10g,磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2％伊红Y溶液20mL，0.65%美蓝溶液10mL，蒸馏水1000mL，PH7.1。

将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121C高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55⁰C，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

(五)克氏双糖铁琼脂(K1)

上层培养基成分：

血消化汤(pH7.6)500mL，琼脂6.5g，硫代硫酸钠0.1g，硫酸亚铁铵0.1g，乳糖5g，0.2％酚红溶液5mL。

下层培养基成分：

血消化汤(pH7.6)500mL，琼脂2g，葡萄糖 1g，0.2%酚红溶液5mL。

取血消化汤，按上层和下层的琼脂用量分别加入琼脂，加热溶解。

分别加入其他各种成分。将上层培养基分装于烧瓶内；将下层培养基分装于灭菌12mm×100mm试管内，每管约2mL。115℃高压灭菌10min。

将上层培养基放在56℃水浴箱内保温；将下层培养基直立放在室温内，使其凝固。俟下层培养基凝固后，以无菌手续将上层培养基分装于下层培养基的上面，每管1.5mL，放成斜面。

(六)克氏双糖铁琼脂(换用方法)

蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，葡萄糖1g，氯化钠3g，柠檬酸铁铵0.5g，硫代硫酸钠0.5g，琼脂12g，酚红0.025g，蒸馏水1000mL，PH7.4。

将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2％酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。

(七)糖发酵管

牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2g，0.2％溴麝香草酚蓝溶液12mL，蒸馏水1000mL，PH7.4。

葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5％加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。

其他各种糖发酵管按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121⁰C高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌。将5mL糖液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36±1⁰C培养，一般观察2～3d。迟缓反应需观察14-30d。

参考资料：食品卫生微生物检验标准手册

相关链接：营养肉汤，麦康凯琼脂，克氏双糖铁琼脂