2种木霉菌对杨树叶枯病致病菌的抑菌活性研究（一）

杨树叶枯病是种木致病由半知菌亚门的链格孢菌(Al-ternariaalternata(Fr．)Keissl3引起的一种杨树叶部病害，它既能危害插条苗，霉菌又会感染实生苗，对杨发病最重者整株叶片全部枯死。树叶该病从杨树叶片抽生开始，枯病危害杨树叶片、抑菌研究嫩梢和幼茎，活性5-6月染病最重，种木致病受害的霉菌叶片会出现近圆形、多角形或不规则形的对杨病斑，直径可达1～5mm，树叶病斑多时可连成大斑，枯病病斑上有黑色霉状物，抑菌研究嫩梢和嫩茎上的活性病斑凹陷，呈菱形，种木致病上有绿色霉层。该病原菌寄生性不强，但寄主范围很广，常发生在农作物、经济作物、果树、蔬菜及杂草上，近年来又在用材林树种及绿化树种上发现，受害地区广泛，主要集中在我国东北、西北、华北地区。而用材林上细链格孢菌，最早发现于一些杨树杂交品种的叶部，形成大量的坏死型病斑，造成叶枯，提早落叶。杨树叶枯病可危害毛白杨、小叶杨、小青杨、银白杨、北京杨等多种杨树，对杨树苗木及幼林造成严重危害；如近几年发生在北京市东北旺苗圃的毛白杨连年受此病的危害，1981年叶片感病率达100％，叶片大量提前脱落，四川省天全县杨树苗圃2000年感病率达85％以上，同时在黑龙江省也曾大面积发生，导致很多苗圃的苗木死亡，给林业生产造成了很大的经济损失，已成为影响当地杨树优质高产的主要因素之一，找到治疗之法已刻不容缓。

目前，由于化学杀菌剂对环境、人体带来的副作用以及病原菌日益明显的抗药性，新的治疗方法的出台势在必行，利用木霉菌作为生物杀菌剂的研究引起了世界各国的广泛兴趣。木霉菌(Trichoder-eelviride)是自然界中普遍存在并有丰富资源的拮抗微生物，常见于植物残体及动物粪便上，从植物的根围及种子、球茎表面即可分离到，具有广泛适应性、产生拮抗物的多样性、寄生的广谱性和对环境影响小等特点，成为最有希望的生防因子。该菌是重要的植物真菌病原菌的抑制菌，具有较强的适应性，通过营养争夺、重寄生、产生抗性物质或溶解酶类可以抑制许多病原菌，因此深入研究、开发和生产优良木霉菌，对于防治植物真菌病害，促进生产具有重要意义。在木霉菌的种群中有一大类被称为拮抗(T.viride)。钩状木霉(T.hamatum)、长枝木霉(T.10ngibrachiatum)、康氏木霉(T．koningii)以及新近归为粘帚霉属的绿粘帚霉(Gliocladiumvirenstrichodermavirens)都属于拮抗类，但目前农业生防上商业化的产品主要是哈茨木霉菌株及少量的绿色木霉菌株，它们在植病生防中正日益受到重视，应用技术也不断突破。多年来，人们对木霉菌的生防应用、生物药剂的开发以及生防机制做了很多尝试和深入研究。国内外许多学者将其用于防治水稻纹枯病，现在，木霉还可以用于叶面、花器和果实的保护：在葡萄园内用绿色木霉的孢子液于始花期至收获期喷施，可以降低灰霉引起的藤蔓腐烂以及果实在储藏期的腐烂，有效地防治灰霉病。在杨树烂皮病的生防研究中发现：木霉对烂皮病菌也有较好的防治效果，林间防治杨树烂皮病治愈率达92.4％，预防效果达82.4％。茆振川报道了木霉菌对苹果轮纹病的抑制作用，而且国外已有商品化的木霉制剂问世，如美国的Topshield(哈茨木霉T-22菌株)和以色列的Trichodez(哈茨木霉T39菌株)；同时在国内，也已经有关于其防治白涓病、猝倒病、灰霉病等的报道。木霉的拮抗机制也是多样性的，一般有竞争作用、抗生作用、重寄生作用等。据不完全资料统计，木霉至少对18个属29种病原真菌在体外或体内表现有拮抗作用。目前叶枯病的防治，在很大程度上还是依赖于化学防治，一般从发病开始在整个生长季节喷洒2～3次的40％的乙膦铝300倍液，或75％百菌清500倍液，或50％的多菌灵l000倍液防治，并通过及时清理枯枝落叶带出林外集中烧毁或埋沤制肥的方法减少病源，从而减少发病率。利用化学方法防治杨树叶枯病时，化学药物在抑制病原菌的同时也将杀死树体上有益的拈抗微生物，同时也会使病原菌产生抗药性并污染环境。在可持续发展呼声越来越高的今天，化学公害越来越严重，木霉作为一类资源丰富的拮抗微生物，在植物病害生物防治中扮演着越来越重要的角色；同时，随着现代生物技术的不断发展，木霉的生防效果和稳定性有了显著的提高，并展示出广阔的应用前景；这些为木霉菌对杨树叶枯病的抑制作用提出了可能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

病原菌：病株取样杨叶枯病病菌

生防菌：绿色木霉、哈茨木霉

1.1.2 培养基的制备

1.2 培养基的制备

试验所用培养基均采用PDA培养基。

配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，琼脂20g，水1000mL；

将洗净后带皮的马铃薯切碎，加入定量的水煮沸30min，用纱布滤出马铃薯残渣，加入琼脂，加热使琼脂完全融化，再加入糖，并补入适量的水，使最后的总量仍然为原量。分装在试管和三角瓶中，然后灭菌备用。

1.2 病原菌的鉴别

1.2.1 症状观察

选取具有典型杨树叶枯病症状的杨树叶片观察，其症状如下：初期，感病叶片上产生隐约可见的褐色斑，以后病斑逐渐扩大。病斑黄色，中央褐色。后期，病斑上产生黑褐色霉状物，为病原菌的分生孢子梗和分生孢子。病斑可相互连成大斑，全叶枯死。

1.2.2 病原茵观察及鉴定

选取具有典型症状的杨树叶片病部，进行镜检。直接用针挑取少许菌丝体，放在加有水滴的载玻片上，加盖玻片后在显微镜下镜检。

1.3 病原菌的分离和纯化

1.3.1 杨树叶枯病病原茵的分离

选择新发病的植株器官或组织作为分理材料然后进行组织表面消毒，消毒时先用70％酒精浸泡病组织2～3S，赶走病组织表面气泡，然后用次氯酸钠消毒，消毒后用灭菌水冲洗2～3次。

次氯酸钠消毒液配方30％(现配现用)：次氯酸钠(NaCl0₃)，30g；水，100mL。

取杨树叶枯病的病叶，直接用移植钩挑取菌株的菌丝，接种于PDA平板中央，于25℃恒温箱中培养3d。3d之后，观察各菌落形态，直接用针挑取少许的菌组织放在加有水滴的载玻片上，加盖玻片后在显微镜下检视，根据菌落形态，确定病原菌。

1.3.2 杨树叶枯病病原茵的纯化

采用微块单孢分离法，挑取供纯化菌种的孢子少许加于试管内的无菌水中，摇动混合1～2min使孢子充分散开。调节孢子浓度到10倍视野中2～5个孢子。取此孢子悬浮液2～3mL倒入4％水洋菜平板表面，轻轻左右摇动培养皿使孢子液均匀展布于培养基表面静置5min，使大部分孢子沉淀，然后倾斜培养皿，用吸管吸去多余的孢子液。用灭菌刀将带有分散孢子的水洋菜平板切成0.3cm×0.3cm小块，移至载玻片上检查。逐个检查，见有单个孢子的微块，随即用移植铲移入PDA培养基中培养，每皿可放4～5块。

1.4 试验方法

在直径9cm培养皿的PDA平板培养基上，相距3CiTi分别接入直径0.6cm培养5d的近乎同质、等量的杨树叶枯病病原真菌和木霉菌(Trichoder-maspp．)。对照则在平板中心各接入直径0.6cm的杨叶枯病病原菌和木霉菌(Trichodermaspp．)。每个处理设置5个重复，置于生化培养箱中，用散射光、25℃培养。每12h测量菌落的半径，连续观察3d。

拮抗结果计算时，采用两菌落相向半径进行拮抗生长测定。

由于拮抗真菌抑制病原真菌的同时，其本身也被病原真菌所抑制，因此在计算拮抗效果时，采用相对抑菌效果，即拮抗真菌被抑制1％个单位所产生的效果。被抑制率与相对抑菌效果的计算m1如下：

被抑制率-[(单独培养菌落半径)-(菌落趋向半径)]／(单独培养菌落半径)×100％；

相对抑菌效果=病原菌被抑制率／拮抗菌被抑制率。

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