高效液相色谱法同时测定鱼腥草芩蓝合剂中7种成分（一）

鱼腥草芩蓝合剂为常见中药制剂，高效由鱼腥草、液相黄芩、色谱时测板蓝根、法同连翘、定鱼金银花5味中药材配制而成，腥草具有清热解毒的芩蓝作用，临床常用于治疗外感风热引起的合剂咽喉肿痛，急性咽炎、中种扁桃体炎等疾病。成分现代药理研究表明，高效该制剂具有良好的液相解热作用，临床治疗小儿疱疹性咽峡炎有较好的色谱时测疗效。鱼腥草芩蓝合剂收录于国家药品监督管理局国家中成药标准中，法同然而现行标准中只有鱼腥草、定鱼黄芩、连翘和金银花的薄层色谱鉴别项和黄芩苷含量的测定项，不能全面地反映复方制剂的内在质量。目前有关该制剂组分含量的测定研究较少，邓茂芳等建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定鱼腥草芩蓝合剂中绿原酸、黄芩苷和黄芩素含量的方法。鱼腥草芩蓝口服液是同方配制的兽药制剂，陆安等以鱼腥草芩蓝口服液为研究对象，建立了HPLC指纹图谱鉴别方法，但未进行含量测定研究；邢玉娟等建立了HPLC法测定鱼腥草芩蓝口服液中黄芩苷和绿原酸含量的方法。鱼腥草中含有绿原酸、槲皮素、槲皮苷等化学成分；黄芩中含有黄芩苷、汉黄芩素和汉黄芩苷等成分；连翘中含有绿原酸、槲皮素、槲皮苷、连翘酯苷A等成分；金银花中含有绿原酸、槲皮素和槲皮苷等成分。笔者在前人研究的基础上，对试验条件进行优化，建立了HPLC法同时测定鱼腥草芩蓝合剂中绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素7种成分含量的方法，为全面控制该制剂的质量提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：UltimateU3000型，配有Chromeleon7.2SR5色谱工作站、真空脱气机、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。电子天平：XPE205型，感量为0.01mg，瑞士梅特勒–托利多公司。超声波提取器：ELMASONICP型，德国艾尔玛公司。纯水仪：MilliPAKadvantageA10型，美国密理博公司。复方鱼腥草合剂样品：某生产企业样品。绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素、汉黄芩素对照品：批号分别为18071907、A19011704、18041002、19091104、18032111、19082203、18030509，纯度（质量分数）分别为96.1%、97.2%、93.3%、100.0%、98.5%、98.8%、99.1%，成都普菲德生物技术有限公司。乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国赛默飞世尔公司。磷酸，分析纯，国药集团化学试剂（北京）有限公司。实验用水为超纯水。

1.2 溶剂配制

对照品单标储备液：分别精密称取绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素对照品各约10mg，其中黄芩苷置于10mL容量瓶中，其它6种化合物分别置于100mL容量瓶中，各加入50%甲醇溶液溶解，稀释，定容至标线，配制成绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素的质量浓度分别为98.5、102.4、994、97.8、101.2、98.8、103.2μg/mL的单标储备液。

混合对照品溶液：分别精密量取上述对照品单标储备液各1mL，置于同一只10mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀释并定容至标线，摇匀，配制成绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素、汉黄芩素的质量浓度分别为9.85、10.24、99.4、9.78、10.12、9.88、10.32μg/mL的混合对照品溶液。

1.3 样品处理

精密量取鱼腥草芩蓝合剂2mL，置于20mL棕色容量瓶中，加入50%甲醇溶液12mL，超声20min，冷却至室温，用50%甲醇溶液稀释至标线，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，待测。

1.4 色谱条件

色谱柱：SymmetryShieldRP18柱(4.6mm×250mm，5μm，美国沃特世公司)；流动相：乙腈–0.1%甲酸溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：初始乙腈体积分数为20%，0～30min，乙腈由20%逐渐增加至40%，保持30min，60～80min，乙腈由40%逐渐增加至80%；流量：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样体积：5μL。

2 结果与讨论

2.1 检测波长选择

所测7种化合物中，绿原酸为咖啡酰奎宁酸类，紫外光谱最大吸收峰为327nm；连翘酯苷A为苯乙醇苷类，最大吸收为330nm；其余成分为黄酮或黄酮苷类，黄芩苷最大吸收波长为278nm，槲皮苷为254nm和350nm，汉黄芩苷为276nm，槲皮素为370nm，汉黄芩素为276nm。各成分之间紫外最大吸收波长差别较大，但在210nm处均有较强的紫外吸收，故选择210nm作为检测波长同时检测7种成分。

2.2 色谱条件优化

分别选择乙腈–水溶液、乙腈–0.1%甲酸溶液和乙腈–0.1%磷酸溶液作为流动相，考察不同流动相体系对7种待测成分的分离效果。结果表明，乙腈–0.1%磷酸溶液作为流动相时，色谱峰形较好，故选择乙腈–0.1%磷酸溶液为流动相。由于7种待测化合物极性跨度较大，采用等度洗脱无法对所有化合物进行分离，故采用梯度洗脱方式。对梯度洗脱程序进行优化，最终确定洗脱程序：初始乙腈体积分数为20%，0～30min，乙腈由20%逐渐增加至40%，保持30min，60～80min，乙腈由40%逐渐增加至80%。在此洗脱程序下，7种化合物在80min内获得较好的分离，峰形较好。

2.3 色谱柱选择

分别对SymmetryShieldRP18柱(4.6mm×250mm，5μm)、AgilentZORBAXEclipseXDB柱（250×4.6mm，5μm）和ODSHHPERSIL柱(4.6mm×250mm，5μm)3种型号的色谱柱进行考察，结果发现，SymmetryShieldRP18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱分离效果最佳，故选择该色谱柱进行方法学考察和样品测定。

2.4 样品提取条件选择

样品为口服液体制剂，溶解性较好，但个别化合物浓度较高，故采用50%甲醇对样品制剂稀释10倍，过滤后直接进样测定。混合对照品溶液和样品溶液色谱图如图1所示。

相关链接：绿原酸，连翘酯苷A，汉黄芩苷，槲皮素

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