巨噬细胞识别酿酒酵母孢子的研究（二）

1.10 单糖或者多糖抑制实验

用培养基配制终质量浓度为1mg/mL的巨噬酵母昆布糖培养液以及5mg/mL的甘露糖、甘露聚糖、细胞半乳糖、识别乳糖以及盐藻糖培养液，酿酒取lmL上述含糖培养液和细胞共孵育30min之后，研究加入1mg的巨噬酵母营养态酵母或1mg酵母孢子或200μg葡聚糖微球，离心后进行吞噬实验并且统计相对吞噬效率。细胞

1.11 野生型孢子和突变体孢子吞噬实验

取1mg的识别野生型酵母孢子、ditl△孢子和chs3△孢子，酿酒按照1.6方法进行吞噬实验。研究

1.12 统计分析

采用Graphprism软件对数据进行分析作图，巨噬酵母所有数据以平均值+标准差表示。细胞用单因素或双因素方差分析(One-WavorTwo-WavANOVA)检验组间的识别差异。检验标准P＜0.05表示差异有统计学意义，酿酒每次实验重复5次。研究对于本实验统计结果，标记如下：P≥0.05标记为ns：0.01＜P＜O.05标记为*；0.001＜P≤0.01标记为**；P≤0.001标记为***；P≤0.0001标记为****。

2 结果与分析

2.1 巨噬细胞内吞野生型酵母孢子效率高于营养态酵母

营养态酵母壁和野生型酵母孢子壁的结构有所不同.比较巨噬细胞对营养态酵母和野生型酵母孢子的响应，结果见图1(a)。随着营养态酵母或野生型酵母孢子质量浓度的增加，巨噬细胞吞噬营养态酵母和野生型孢子的数目呈上升趋势。当营养态酵母和孢子质量均为lmg时，巨噬细胞吞噬营养态酵母和孢子的情形见图l(b)。统计分析表明，此时每100个巨噬细胞吞噬酵母或孢子的个数分别为35个和320个。质量为1mg时，酵母孢子个数约为营养态酵母个数的3.7倍，此时孢子被吞噬个数约为营养态酵母个数的9倍。这表明巨噬细胞对酵母孢子内吞效率显著高于营养态酵母。

2.2 巨噬细胞对酵母孢子的内吞是依赖于Syk和P13K的吞噬过程

巨噬细胞对大颗粒微生物的内吞主要是通过巨胞饮和吞噬过程。巨胞饮指的是细胞依赖于细胞膜流动性的非特异内吞大颗粒过程；吞噬过程指的是免疫细胞膜上受体介导的并且依赖于Syk途径的内吞过程。已有的研究表明，巨噬细胞吞噬葡聚糖微球依赖于Syk，通过白皮杉醇抑制Svk能够抑制巨噬细胞对葡聚糖微球的吞噬。利用Svk抑制剂白皮杉醇阻断Svk所介导的信号通路见图2(a)。与对照组相比，增加白皮杉醇的浓度会增强抑制巨噬细胞对葡聚糖微球、营养态酵母和野生型孢子的吞噬作用。这表明巨噬细胞对野生型酵母孢子和酵母的内吞途径是依赖于Svk受体介导的吞噬过程。有研究表明，巨噬细胞吞噬较大颗粒依赖于P13K，配制不同浓度的渥曼青霉素测定其对巨噬细胞吞噬营养态酵母和野生型酵母孢子的影响。如图2(b)所示，与对照组相比，渥曼青霉素对巨噬细胞吞噬酵母和葡聚糖微球无显著影响；随着渥曼青霉素质量浓度的增加，其对巨噬细胞吞噬野生型酵母孢子的抑制作用增强。这表明尽管野生型孢子直径小于营养态酵母.其吞噬途径是极其依赖于P13K的过程.而营养态酵母的吞噬过程不是显著依赖于P13K的过程。因此，巨噬细胞对营养态酵母和野生型酵母孢子的吞噬依赖Svk下游不同激酶，表明巨噬细胞吞噬营养态酵母和孢子所依赖的信号途径不同。

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