肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA标准物质的研制 （五）

2.6协作验证结果

EAEC标准物质通过3家协作验证实验室的肠道肠埃标定，测定结果如表7所示，集聚菌菌EAEC菌体标准样品菌含量均为103CFU/样品，性大希氏与研制的体和目标值一致。生化和特征基因PCR鉴定结果符合EAEC的标准特征。同时EAECgDNA标准物质特征基因PCR鉴定结果也符合实验要求。物质

2.7标准物质使用效果验证

选择熟肉制品、肠道肠埃乳粉、集聚菌菌腐乳、性大希氏饼干和薯片5种食品基质共20份样品对EAEC标准物质的体和使用效果进行验证，检验结果显示，标准20件样品正常检验（作为本底对照）分离平板上未见可疑菌落，物质而加入标准物质的肠道肠埃样品在分离平板上均有可疑菌落生长，并通过PCR检测扩增得到相应的集聚菌菌特征基因条带，与gDNA标准物质扩增条带大小一致。性大希氏结果表明，研制的标准物质和基因组标准物质适用于食品中肠道集聚性大肠埃希氏菌检验的质控需求。

3讨论和结论

准确快速的检测技术是及时有效控制和预防由病原菌引起的食源性疾病的重要手段。目前食品和腹泻病人中致泻大肠埃希氏菌的检测越来越受到关注和重视。由于致泻大肠埃希氏菌种类繁多的血清群/型，给检验工作带来很多挑战。快速准确的检验工作不仅依赖于不同技术的检验方法，还需要科学使用标准物质来保证实验结果的准确性。目前，国内针对微生物标准物质的研制已有较大的发展，标准菌株多来自美国菌种保藏中心（ATCC），而且对于标准菌株的鉴定方式多为传统的生化反应。目前对于具有我国自主知识产权而且具有清晰全基因组序列信息的标准物质研究还是空白。本研究采用的EAEC标准菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心（CMCC），分离自我国腹泻病人，具有我国自主知识产权。

全基因组测序技术在微生物领域研究中发挥着越来越重要的作用。随着测序技术所获得数据量的突破性进展，测序速度和费用得到大幅度改观。而且二代测序数据分析软件的日趋完善，非生物信息学专业人员可以使用网页类型分析工具对微生物基因组测序数据完成微生物遗传特征、溯源等信息分析。RapidAnnotationusingSubsystemTechnology(RAST，http://rast.nmpdr.org)能够快速注释基因组信息、CenterforGenomicEpidemiology(CGE，https://cge.cbs.dtu.dk/)网站拥有方便快捷的独立数据分析工具，可以进行种属鉴定、耐药基因、毒力因子、质粒分型以及菌株分子分型等特征分析。这些网页类型分析工具可提供更为直观的用户界面和简便的操作环境。本研究利用RAST、PATRIC、CGE对EAEC进行了种属鉴定、血清分型和除astA、aggR、pic特征基因之外的毒力基因分析，为标准物质的研制奠定了科学准确的基础。

本研究根据国家标准GB4789.6中的引物序列对EAEC标准物质进行了特征性基因扩增。实验结果显示，astA、aggR和pic基因得到清晰的扩增条带，说明PCR扩增结果和全基因组测序数据结果准确对应。在传统的生化方法基础上，利用PCR技术对毒力基因进行扩增，是提高EAEC检出率的有力手段，同时也为标准物质的检验提供了快速准确的方法。

目前研究中报道的相关标准物质包括DNA标准物质是以粉末形式冻干，本研究制备的EAEC菌体标准物质和gDNA标准物质均以小球的形式进行冻干，相比较粉末形式冻干，该标准物质使用避免了由于粉末开盖带来的污染和质粒污染，并且省去离心步骤，操作更加方便，同时该标准物质易于溶解，计数更准确。

本研究制备的EAEC菌体标准物质均匀性良好，经单因素方差分析符合标准物质的要求。经过25℃、37℃运输稳定性测试，7天仍能保持样品中菌含量在103CFU/样品水平，可以保证样品在非极端的高温天气下运输不受影响，而且在-20℃条件下可以长期储存。对于EAECgDNA标准物质，同样具有很好的稳定性。考虑到食品基质的复杂性，本研究选用5种不同的食品基质对标准物质进行了验证，结果显示加入标准物质的样品均能检测到EAEC，说明研制的菌体标准物质和gDNA标准物质适用于食品中EAEC的检验，满足质控要求。

综上所述，EAEC是造成人体中重度腹泻的重要病原菌之一，开展食品中EAEC检测工作对维护人类健康意义重大。本研究研制的具有自主知识产权和全基因组数据的EAEC菌体标准物质和gDNA标准物质均匀性和稳定性良好，为EAEC的检验工作提供了有效参考，保证检测结果的准确性，有利于保证食品质量与安全。该标准物质可用于实验室质量控制及实验室间比对，保证我国食品安全质量检测数据的可靠、可与国际互认。

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