氨基甲酸乙酯降解酶的固定化研究（二）

1.3. 4挥发性风味物质的氨基检测

1) 香气化合物提取

根据顶空固相微萃取法(HS-SPME)改进的方法[31]提取挥发性风味化合物，并用GC/MS进行分析。甲酸降解究将10mL“美乐”葡萄酒样品和3.6gNaCl放入15mL萃取瓶中，乙酯再加入20uL20mg/L的固定3-辛醇标准溶液。萃取瓶用内衬密封，化研样品在45℃下平衡20min，氨基微萃取在45℃、甲酸降解究500r/min的乙酯搅拌下持续60min。萃取结束将萃取头插入进样口解吸5min。固定

2) 色谱条件

用Agilent7890B气相色谱仪与5977A质谱仪进行GC-MS分析。化研色谱柱型号HP-Innowaxcolumn柱(60m×2.5mm×0.25μm)，氨基载气是甲酸降解究流量为1mL/min的氦气，进样口温度230℃。乙酯柱温采用程序升温：初始温度50℃保留5min，固定以3％/min升至125℃保留3min，化研然后以2℃/min升至180℃保留3min，最后以15℃/min升至230℃保留15min。

质谱仪在电子轰击源(EI)的电离模式下运行，使用问隔为0.2S的全扫捕模式(扫捕范围m/z40～450)，离子源温度200℃。

定性和定量分析：通过将各组分峰中的化合物与NISTl4.L谱库的标准化合物进行匹配，并将得到的质谱和保留指数(RI)与NISTl4.L谱库巾的标准化合物进行比较。用内标法计算各组分的相对含量，结果表示为3个重复的“美乐”葡萄酒样品的平均值±标准差。

2 结果分析

2.1 壳聚糖载体交联条件的优化结果

2.1.1 交联剂体积分数对载体制备的影响

壳聚糖微球载体悬挂醛基的数量与其固定化酶能力的强弱有关。不同体积分数的戊二醛对壳聚糖微球载体上悬挂醛基质量分数的影响见图2。

由图可知，在一定范围内，随着戊二醛溶液体积分数的增加，载体上的悬挂醛基质量分数呈上升趋势，但是当戊二醛溶液体积分数达到5％时，载体上悬挂醛基质量分数达2.4％，之后随戊二醛体积分数增加，载体上悬挂醛基反而趋于平稳。使用不同加酶量，测得数据与此一致。结果说明，体积分数5％的戊二醛溶液已经可以提供足够多数量的醛基与壳聚糖载体上的氨基发生交联反应，此时载体对酶的固定量达到最大。因此载体制备时选用体积分数为5％的戊二醛溶液作交联剂即可。

2.1.2 交联时间对载体制备的影响

如图3所示，在2～8h范围内，载体上的悬挂醛基随交联时间的增加而增加；当交联时问达到8h后，悬挂醛基的质量分数基本保持不变。说明8h的交联时间足以使戊二醛溶液中的醛基与载体上的氨基充分反应，使载体对酶的固定量最大。因此，选择8h作为壳聚糖微球载体和戊二醛溶液的交联时间。

2.2 固定化EC降解酶的酶学性质

2.2.1 固定化EC降解酶的最佳反应温度及其稳定性如

如图4所示，通过游离酶和同定化酶在30、36、42、48、54、60、66℃和72℃条件下的酶活结果可知，它们的最适温度分别为30℃和42℃。同定化酶在30～42℃酶活性逐渐增高，最适温度比游离酶略高；在42℃以后降解EC能力逐渐降低，与酶活呈下降趋势的游离酶变化基本一致；但固定化酶的酶活在42～72℃均高于游离酶。

出现最适温度转移可能是南于EC降解酶的空问结构受到同定化载体的影响而略有改变，尤其是在42℃以后，固定化EC降解酶的空间结构较为稳定，催化底物能力比游离酶略高。也有其他研究结果表明固定化脲酶与游离酶的最适催化温度有所差异，但二者的催化效果并不存在显著差异。

稳定性结果显示，同定化EC降解酶在42℃条件下存放24h后相对酶活仍能达到60％以上，说明固定化EC降解酶能够耐受一定范围的温度，对环境的适应性较好，在室温环境下无需低温保护，是一种环境友好型固定化酶。

2.2.2 固定化EC降解酶的最适pH及其稳定性

从图5可以看出，在pH为3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5和4.8的条件下，游离酶和固定化酶催化底物EC的最适pH有所偏离，游离EC降解酶对pH4.5的EC溶液具有最大的催化活性，且在pH3.0～4.5酶活性逐渐增加，相对酶活在30％～100％之问；同定化EC降解酶的最适pH为3.6～3.9，且在此范围内酶活性均高于游离酶，尤其在pH3.6左右表现出最大催化活性。

稳定性结果显示，固定化酶在最适pH条件下反应时间越长，相对酶活性的下降速度越快，尤其是12～24h期问的相对酶活变化率远远高于0～12h的变化率。同定化酶在pH3.6条件下放置24h之后的酶活损失率不超过40％，说明固定化EC降解酶的耐酸性较游离酶好，更适于复杂环境的操作。之前就有研究将以京尼平为交联剂与来源于普罗维登斯菌(ProvidenciarettgeriJN-B815)的酸性脲酶进行交联，发现此交联酶能够适应黄酒的复杂微环境并去除尿素和EC。
 

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