罗望子种仁球蛋白结构和功能特性的构效关系（一）

罗望子（TamarindusindicaL.），罗望又名酸角，种仁属豆科，球蛋是白结一种高大常绿乔木，多见于我国西南省份且多呈半野生状态。构和功罗望子的特性营养价值丰富，其种皮富含单宁、效关系色素；果肉富含多糖、罗望有机酸等营养成分；种仁则以蛋白质、种仁多糖及脂肪等为主要成分，球蛋其中多糖约占种仁的白结60%，常作为增稠剂和稳定剂应用在食品、构和功饮料及烟草工业上，特性而对于提取多糖后残渣的效关系综合利用研究甚少。探究罗望子种仁多糖提取后残渣的罗望营养成分并对其进行综合利用，从而实现种仁产业链的延长刻不容缓。

Reddy等研究表明提取多糖后的罗望子种仁残渣中仍含有丰富的蛋白质，在印度、苏丹等酸角主产国常被开发成饲料。我国虽然盛产罗望子，然而对其科学研究起步较晚且由于提取种仁多糖后的残渣部分含有黏稠性的不易加工的残余多糖，因而在工业上常当作废料处理，这不仅污染环境，而且资源大量浪费。蛋白质的结构与功能息息相关，其氨基酸构成、分子质量的大小、形态和空间结构等因素对蛋白质的功能和理化性质均有较大的影响，如蛋白质的肽键及氨基酸侧链能够显著影响其溶解性，而其乳化性质受到自身分子大小及表面亲疏水性等因素的影响。自上世纪70年代以来，众多学者相继测定了罗望子种仁的营养成分，发现罗望子种仁中蛋白含量高达19.4%，且以种仁球蛋白（Tamarindseedglobulin，TSG）和白蛋白为主，TSG中含有18种氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸含量较高。此外，TSG的氨基酸种类齐全，评分较高，必需氨基酸指数为71.5，除苏氨酸和酪氨酸外其它6种必需氨基酸俱全，尤以赖氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸最为丰富。上述研究证实罗望子种仁蛋白是一种优质植物蛋白资源，具有较强的开发价值。目前对于罗望子种仁蛋白质结构、功能特性及其构效关系尚未见研究报道。本文以罗望子种仁提取多糖后的残渣为原料，提取罗望子种仁球蛋白，通过电泳、巯基二硫键含量及氨基酸组成等分析指标对其蛋白结构进行分析，并测定其溶解性、乳化性及乳化稳定性，研究其构效关系，为日后TSG的功能注释及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗望子种仁提取多糖后残渣，来自云南猫哆哩集团食品有限责任公司；大豆分离蛋白，购于山松生物制品有限公司；九三非转基因一级大豆油，购于九三粮油工业集团有限公司。柠檬酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯），购于哈尔滨市化工试剂厂；SDS、TEMED、丙烯酰胺、甲醇、冰醋酸、亚甲基双丙烯酰胺（均为分析纯），购于天津市志远化学试剂有限公司；葡聚糖凝胶SephadexG-50，购于Summus公司；考马斯亮蓝R-250（分析纯），购于天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

FW-135粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；TDL-4A离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；722紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DYY-7C垂直电泳仪，北京市六一仪器厂；ThermoUltiMate3000高效液相色谱仪，上海硅仪生化科技有限公司；FJ300高速均质乳化机，上海沪析实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 罗望子种仁蛋白的提取

罗望子种仁提取多糖后的残渣中残留多糖含量为（0.86±0.45）%，采用超声辅助碱溶酸沉法从残渣中提取TSG，将去除多糖的沉淀与pH7.4的Tris-HCl缓冲液混合配置为质量浓度为25g/L的溶液，调节溶液pH值为12.5，使用恒温磁力搅拌器于65℃下搅拌1.5h后放入250W超声清洗器内超声1h，超声后的溶液在4000r/min的条件下离心15min，上清液备用，沉淀重复上述步骤。合并上清液，调节pH值为TSG的等电点4.6静置30min后，于8000r/min离心10min，所得沉淀即为粗TSG。再通过Osborn法将提取过TSG的沉淀与去离子水混合（33.3g/L），使用恒温磁力搅拌器室温搅拌1h，于8000r/min离心15min，所得上清液即为清蛋白，保留沉淀继续提取盐溶蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白，提取操作同上，但所用溶剂不同，依次为5%的NaCl溶液、70%乙醇和0.25%的NaOH溶液。本试验主要对含量最高的，具有良好物化性质的TSG进行研究，因此将提取的粗TSG溶于去离子水调节至中性pH7.0再通过葡聚糖凝胶柱层析法纯化，获得高纯度TSG，冷冻干燥用于后续试验。

1.3.2 SDS-PAGE测定分子质量

根据Laemmli等的方法，采用SDS-PAGE凝胶电泳测定制备的TSG分子质量。配制12%分离胶，5%浓缩胶，采用垂直电泳装置电泳，考马斯亮蓝染色，通过凝胶呈像系统扫描，QuantityOne软件分析。

1.3.3 巯基（SH）和二硫键（S-S）含量的测定

根据Wen等的方法稍加修改，对游离巯基含量进行测定，0.5mL1mg/mLTSG溶液加入2.5mLTris-Gly缓冲液（含8mol/L尿素，pH8.0）和0.02mL4mg/mLDTNB快速混合，将其置于25.0℃水浴30min后用分光光度计测定在412nm处的吸光度值，使用公式（1）计算游离SH含量。

式中：A₄₁₂—412nm处吸光值；D—蛋白样品稀释倍数；C—样品蛋白质质量浓度，mg/mL。

参考Wen等的方法并适当修改，对二硫键含量进行测定，0.5mL1mg/mLTSG溶液加入5mLTris-Gly缓冲液（含10mol/L尿素，pH8.0）和0.1mLβ-巯基乙醇，于25.0℃混合反应1h，加入30mLTCA（质量浓度120g/L）沉淀大分子蛋白并于10000r/min离心10min，重复3次，收集沉淀物溶于15mLTris-Gly缓冲液（含8mol/L尿素，pH8.0）中，加入0.15mLDTNB（4mg/mL）快速混合，将其置于25.0℃水浴30min，使用紫外分光光度计在412nm处测定吸光度值，进行S-S含量的计算，公式如（2）所示。

式中：C_′SH—总巯基含量，μmol/g；C_SH—游离巯基含量，μmol/g。

1.3.4 氨基酸的测定

参照卫阳飞等的方法取0.50g蛋白样品加入10mL6mol/L的盐酸，于110.0℃水解24h，抽滤，经60.0℃反复旋转蒸发3次，定容至10mL，过0.45μm的滤膜，样品备用。

采用PITC柱前衍生氨基酸分析法对氨基酸含量进行分析，精密量取800μL混合氨基酸标准品溶液，置于5mL离心管中。加入400μL1mol/L的三乙胺乙腈溶液，混匀，随后精密加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液400μL，混匀后室温放置1h，加入2mL正己烷，剧烈振摇，静置10min，取下层溶液过0.22μm滤膜注入高效液相色谱仪中进行色谱分析并记录色谱图；另精密量取样品测定溶液400μL，测定方法同上，参照GB5009124-2016对氨基酸含量进行计算。

相关链接：谷氨酸，丙烯酰胺，冰醋酸，三羟甲基氨基甲烷

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