响应面优化超声提取甘草渣总黄酮工艺及抗氧化研究（一）

甘草为豆科甘草属乌拉尔甘草、面优胀果甘草或光果甘草的化超化研干燥根和根茎，多生长在干旱、声提半干旱的取甘草原、沙漠或丘陵地带，草渣是总黄一味常用大宗药材，被称为“国老”，酮工在中医里有“十方九草”之说，艺及不仅本身具有补脾益气、抗氧清热解毒、面优祛痰止咳、化超化研缓急止痛、声提抗氧化、取甘保肝和增强记忆力的草渣功效，还在中药配伍中具有调和诸药，总黄以增加药效的作用。

目前，从甘草中分离出的化合物有400多种，其中黄酮类化合物含量最多，且生物活性较强，其因连有异戊烯基，使得其脂溶性增加，具有抗炎、抗氧化抗病毒川、抗肿瘤、抗抑郁、镇静和镇痛等功能，并对人类免疫缺陷病毒有较强的抑制增殖作用，其潜在的药用价值巨大。目前的提取方法主要有：有机溶剂提取、碱性稀醇或碱性水提取、超声提取、微波提取、超临界萃取、酶解提取等方法。其中超声提取法是不仅高效、省时、低成本，而且超声波具有空化作用、热效应和机械搅拌等作用，在提取天然物质时，对有效成分的破坏性小。

甘草渣是提取甘草酸后剩余的药渣，有研究表明其中含有大量的黄酮类物质，为了更高效的利用药材，本实验以甘草渣为研究对象，对超声辅助提取其总黄酮的工艺进行了研究，得到最优提取条件，并对其抗氧化能力进行了考察，以期对今后甘草的利用和开发提供参考。

一、实验仪器与材料

1、实验材料与试剂

无水乙醇、氢氧化钾：天津市永大化学试剂有限公司；硫酸亚铁：天津市博迪化工股份有限公司；水杨酸：天津市百世化工有限公司；双氧水：天津欧博凯化工股份公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本光和纯药；维生素C：北京索莱宝科技有限公司；铁氰化钾：天津市科密欧化学试剂有限公司；三氯乙酸：天津市永大化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。甘草苷：潍坊华植生物科技有限公司；甘草购于石家庄某公司。

2、仪器

KQ5200DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SZF-06A型快速提取仪：上海新嘉电子有限公司；R201C型真空旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；TGL-10B型高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-6000PC型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海博讯实业有限公司；B-260型恒温水浴锅：上海亚荣生化仪器厂。

3、方法

（1）甘草苷对照品的配置

准确称取甘草苷15mg置于25mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液至刻度，制成浓度为0.6mg/mL的甘草苷对照品溶液，置于4℃条件下，备用。

（2）甘草渣中总黄酮的提取

取适量甘草，粉碎，过60目筛后准确称取100.0g于烧杯中，加入含0.3%氨水的60%的乙醇水溶液500mL，80℃回流提取2次，每次2h，过滤后滤渣即为甘草渣，干燥后备用。

准确称取备用甘草渣2.0g于容器中，加入70%乙醇溶液，超声处理后，在一定温度下进行回流提取。过滤后5000r/min离心10min，取上清液进行浓缩、再用70%乙醇溶液进行溶解定容至25mL即为样品溶液，置于4℃条件下，备用。

（3）总黄酮的测定

准确移取不同梯度浓度的对照品溶液于25mL的容量瓶中，加0.5mL的氢氧化钾溶液（10%），震荡使混合均匀，室温下放置10min，70%乙醇溶液定容。以70%乙醇溶液作为空白对照，在400nm处测定其吸收值。以对照品溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y=0.01799X+0.05153，R²=0.9991，结果表明在浓度为6ug/mL～60μg/mL的范围内，其浓度与吸光度呈良好的线性关系，见图1。

移取0.8mL样品溶液于25mL的容量瓶中，重复上述操作，测得其吸收值，带入回归方程中，得出其总黄酮的含量，按照公式（1）计算收率。

（4）单因素试验

①料液比对甘草渣总黄酮收率的影响

精确称取2.0g甘草渣，分别以料液比1:25（g:mL）、1:30（g:mL）、1:35（g:mL）、1:40（g:mL）和1:45（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超声30min，在60℃下回流提取2h。

②超声时间对甘草渣总黄酮收率的影响

精确称取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，分别超声10min、20min、30min、40min、50min和60min，在60℃下回流提取2h。

③提取时间对甘草渣总黄酮收率的影响

精确称取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超声40min，在60℃下分别提取lh、2h、3h和4h。

④提取温度对甘草渣总黄酮收率的影响

精确称取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超声40min，分别在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下提取2h。

（5）响应面优化实验

在单因素试验的基础上，选择超声时间、提取时间和提取温度为自变量，以提取率为响应值，进行Box-Behnken响应面实验设计，每个因素取3个水平，所有实验重复3次。具体因素实验水平见表1。

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