四逆散研究进展及质量标志物的预测分析 （一）

四逆散出自汉代张仲景《伤寒论》，逆散由柴胡、研究白芍、进展及质枳实和甘草四味常用中药配伍而成。量标方中柴胡以其疏肝解郁，志物透邪外出功效作为君药。测分白芍以敛阴养血柔肝作为臣药，逆散与柴胡合用，研究以补养肝血，进展及质条达肝气；佐以枳实理气解郁，量标泄热破结，志物与柴胡为伍，测分一升一降，逆散加强舒畅气机之功，研究并奏升清降浊之效；与白芍相配，进展及质又能理气和血，使气血调和。使以甘草，调和诸药，益脾和中。综合四药，共奏透邪解郁，疏肝理脾之效，使邪去郁解，气血调畅，清阳得伸，四逆自愈。

中药质量标志物（Q-marker）是近年来提出的中药质量评价与质量控制的核心概念，自提出后我国学者对其展开了广泛研究，但迄今为止，大多数研究仍仅限于单味药材和饮片的质量标志物研究，尚不能全面反映质量标志物概念的所有要素。基于中药质量标志物的定义和基本要求，本文在对四逆散化学成分、药理作用、临床应用研究的基础之上，结合Q-marker新思路，并以其“五原则”理论为指导，对四逆散Q-marker的确定进行分析与论证，为四逆散质量标志物的分析提供理论参考。

1 主要化学成分

中药复方是一个包含多个组分的复杂系统，是中医临床用药的主要形式及手段，但因其成分复杂、基础研究薄弱、有效成分不明确、作用靶点多等缺点限制了中药复方在更多领域的发展与应用。中药药效物质基础及质量控制的关键是对其化学成分的分析。目前对四逆散单味药化学成分或复方中有效部位的分离分析研究较多。孙宗喜等通过水蒸气蒸馏法提取柴胡根和茎中的挥发油成分，并用GC-MS对其化学成分进行分析鉴定。两部位共鉴定出95个化合物，其中根和茎中含量较高的成分分别是正己醛(17.00%)及棕榈酸(10.79%)。郭敏娜等利用HPLC-Q-TOF-MS技术对柴胡所含的化学成分进行分析，该研究共鉴定了21个化合物，包括3个酚酸类化合物，4个黄酮类化合物，14个三萜皂苷类化合物，其中异绿原酸A、异绿原酸B、7,3′-二甲氧基槲皮素、5-羟基-7-乙酰氧基黄酮等四个化合物为柴胡中新发现的化合物。

白芍所含有的主要化学成分包括萜类、黄酮类、鞣质类等。母会丹等采用超高压液相色谱-飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)技术来分析白芍甲醇提取物中的化学成分，推测出没食子酰基蔗糖，芍药苷亚硫酸酯，芍药内酯苷，芍药苷，没食子酰芍药苷及其3种同分异构体和苯甲酰芍药苷等9个化合物的化学结构。任浚萁等运用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(LC-ESI/MS)分析鉴定出白芍乙醇提取物中的芍药内酯苷、异芍药苷、芍药苷亚硫酸酯、没食子酰基芍药苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷和苯甲酰氧芍药苷8种化合物。孙东东等对白芍水提物中的化学成分进行HPLC-ESI-Q-TOF-MS定性分析，结果得到没食子酸、芍药苷、白芍苷等11种化合物。

枳实所含有的主要化学成分包括黄酮类、生物碱和挥发油类。于国华等应用超高效液相色谱-线性离子阱轨道阱串联质谱联用技术(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS)定性分析了枳实中的27个化合物，其中有14个黄酮类化合物，7个香豆素类化合物，5个柠檬苦素类化合物和1个生物碱类化合物。袁伟彬等采用水蒸气蒸馏法提取枳实中的挥发油成分，通过GC-MS分析鉴定出19种组分，其中含量最高的为柠檬烯。冯锋等利用溶剂萃取及柱层析法对枳实的化学成分进行分离、纯化；同时，该研究还采用光谱技术对分离得到的化合物进行鉴定，得到圣草次苷、新北美圣草苷、5，7-二羟基香豆素、柚皮芸香苷、东莨菪内酯、橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、花椒毒酚、枳属苷、异樱花苷、柚皮素等10个化合物。

甘草的主要化学成分有黄酮类和三萜皂苷类。刘育辰等分别用硅胶、Sephadex LH-20凝胶、RP-18、MCI等柱色谱分离纯化出甘草中的二十四烷酸、白桦脂酸、齐墩果酸、甘草苷、甘草酸等33种化合物。胡耿等采用HP-20大孔树脂、硅胶、ODS、凝胶等多种柱色谱，结合制备液相等方法对甘草中的黄酮类成分进行分离和纯化，得到10个黄酮类化合物，分别鉴定为异甘草查耳酮B、甘草异黄酮G、异甘草素、异甘草苷、刺甘草查耳酮、香豌豆酚、芒柄花苷、2(S)-3´,5´,7-三羟基二氢黄酮、南酸枣苷、4´,7-二羟基黄酮。赵艳敏等采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术（HPLC-QJTOF-MS）鉴定出甘草50%甲醇提取物中的化学成分，包括28个黄酮类、11个三萜皂苷类和1个香豆素类化合物。

2 药理作用

2.1抗抑郁作用

周静洋等在四逆散抗脂多糖（LPS）诱导小鼠抑郁的研究中，发现四逆散能缩短抑郁小鼠不动时间，降低血清IFN-γ含量且能抑制吲哚胺2，3过氧化酶（IDO）活性及mRNA表达数量，推测四逆散可通过阻断炎性因子诱导IDO激活途径抑制IDO的活性并降低其含量，从而调节TRP-KYN代谢发挥抗抑郁作用。

此外，有研究表明四逆散还可通过阻断炎性因子诱导IDO的激活途径使IDO活性降低和含量减少，发挥抗抑郁作用。王慧慧等在网络药理学结合“药作用机理辅助解析系统”对四逆散成分-靶点-疾病几者之间的关系展开研究，结果发现四逆散可通过调控β2 肾上腺素、5-羟色胺受体 1A、组胺 H1 受体等多个相关靶点调节cAMP环核苷酸系统、神经系统及其递质、免疫炎症反应、神经内分泌、钙离子及其他离子转运等多途径、多靶点发挥抗抑郁作用。

严灿等以cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和p-CREB蛋白表达为指标，采用免疫组化法及Westernblot法研究加味四逆散对皮质酮和谷氨酸致损伤的PC12细胞中CREB及其磷酸化的影响，发现加味四逆散的含药血清能使PC12细胞模型中CREB和p-CREB的表达明显升高；同时cAMP-CREB信号级联反应激活，故认为受体后cAMP-CREB信号通路是加味四逆散发挥抗抑郁作用的机制之一。

彭淑芹等在研究四逆散对抑郁模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）、海马脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体型酪氨酸激酶B（TrKB）的影响中，发现四逆散高低剂量组（10，5g/kg）均可显著降低抑郁症模型大鼠血浆皮质醇（CORT）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的含量；同时升高大鼠海马BDNF及其TrKB阳性神经元面密度值，改善抑郁模型大鼠的抑郁状态，由此推测四逆散可通过HPA轴增加海马BDNF、TrKB的表达而发挥抗抑郁作用。刘琰通过中医分时给药研究加味四逆散抗抑郁作用，观察卯时（7：30）、酉时（17:30）分别给药对慢性应激大鼠的影响，结果表明加味四逆散具有明显的抗抑郁效果。

此外，有学者通过研究发现四逆散可改善慢性应激抑郁模型大鼠的抑郁状态，增加蔗糖水的消耗量。还有研究发现四逆散有效部位能够缩短小鼠强迫游泳和悬尾不动时间、拮抗利血平降低小鼠体温、引起小鼠眼睑下垂的作用，明显增加5-羟色氨酸（5-HTP）诱导小鼠的甩头次数，以上实验结果均表明四逆散有效部位对小鼠抑郁行为具有一定改善作用，其作用机理与增加突触间单胺类神经递质有关。

2.2镇静催眠作用

刘立研究表明，四逆散水煎液能够延长阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间；同时，该实验以正交设计方法寻找四逆散中延长阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间的最佳药物组合，结果表明，四逆散整方延长阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间效果最为显著。刘思源用四逆散对睡眠剥夺大鼠模型和正常大鼠进行干预，发现四逆散有改善睡眠剥夺大鼠脾淋巴细胞增殖功能的作用。

神经递质5-羟色胺（5-HT）及5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）在调节机体睡眠过程中扮演重要角色，5-HT是最早发现与睡眠-觉醒有重要关系的神经递质之一，可参与情绪调控、睡眠-觉醒调控等多种生理活动。

5-羟色胺1A受体(5-HT1A)是5-HT的一个亚型，主要分布于脑内海马、中缝核及脑皮层边缘区，将微量5-HT1A受体激动剂8-羟四氢萘（8-OHDPAT）注入背侧中缝核（DRN）能够增加5-HT1A表达量，减少中缝核神经元的激活及其末梢5-HT的释放，延长REMS，从而达到镇静催眠的作用。于爽对大鼠各睡眠时相与中缝核5-HT的代谢产物5-HIAA含量之间的相关性及四逆散镇静催眠的5-HT神经递质机制展开研究。

结果发现，正常大鼠或电刺激所致睡眠剥夺大鼠处于睡眠状态时，慢波睡眠第1期(SWS1)与慢波睡眠第2期(SWS2)期间的脑部中缝核5-HIAA含量均降低，故推测四逆散冻干粉剂镇静催眠的机制与影响脑部中缝核的5-HT含量有关。张树明发现四逆散有效组分明显增加给药后小鼠全脑、丘脑、脑干内一氧化氮（NO）含量及小鼠全脑、脑干肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、丘脑白细胞介素-6（IL-6）水平，降低全脑、脑干前列腺素D2（PGD2）含量，表明四逆散有效组分具有改善睡眠的作用。

此外，另有研究表明四逆散不仅对失眠模型动物具有镇静催眠作用，对正常小鼠也具有催眠作用，且与戊巴比妥钠有协同作用。

果蝇携带有大量与人类睡眠基因相同的基因，因此，以果蝇作为睡眠研究的模式生物具有独特优势。李玉萍利用光照和机械刺激的方法复制雌、雄果蝇睡眠剥夺模型，以果蝇头部5-HT的含量及5-HT1A受体的表达差异来探讨四逆散冻干粉影响果蝇睡眠作用的机制，结果发现四逆散冻干粉能提高果蝇头部5-HT的含量及5-HT1A受体的表达，表明四逆散冻干粉可通过影响果蝇头部5-HT含量及5-HT1A受体的表达量有关。

2.3 保肝作用

罗闳丹等通过蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝炎模型，以小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）及肝组组织中三酰甘油（TG）、丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力为评价指标，观察四逆散对MCD所诱导的酒精性脂肪肝炎的作用，结果发现四逆散能降低酒性脂肪肝炎模型小鼠血清ALT、AST及肝脏TG、MDA含量，升高血清中TG含量，增加肝脏组织中SOD的活力；同时病理观察发现四逆散能减少模型组小鼠肝细胞内脂肪空泡和炎性细胞浸润。表明四逆散对MCD饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝炎有预防作用。

此外，四逆散还具有发挥抗肝损伤、促进肝损伤修复的作用，柴智等以雷公藤多苷复制肝损伤模型，运用四逆散对该模型进行干预，发现经四逆散灌胃治疗后，发现四逆散组较模型组肝组织中Bcl-2表达升高、Bax蛋白及肿瘤坏死因子（TNF-α）mRNA表达下降、Caspase-3酶活性降低，表明四逆散对肝细胞具有一定保护作用。

徐卫东等研究表明四逆散含药血清能够促进肝脏干细胞增殖并诱导其分化，促进肝损伤修复。此外，四逆散还具有抗肝纤维化的作用，研究发现四逆散可通过下调RhoA基因和蛋白的表达，调控RhoA/ROCK通路、阻断JAK2-STAT3通路信号转导作用等途径，抑制肝星细胞的活化与迁移、抑制肝星状细胞（HSC）增殖，促进HSC凋亡，减少肝细胞外基质（ECM）的生成，从而起到抗肝纤维化的作用。

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