栀子黄对淀粉消化酶的抑制动力学及相互作用研究（一）

糖尿病是栀黄制动一种多病因综合作用导致的代谢性疾病，其特点是对淀的抑慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌不足和（或）作用障碍引起的粉消糖、脂肪、化酶互作蛋白质代谢紊乱。力学世界卫生组织将糖尿病主要分为两类：Ⅰ型糖尿病，及相究主要原因是用研胰腺β-细胞遭到破坏，导致血浆胰岛素水平低下；Ⅱ型糖尿病，栀黄制动是对淀的抑一种非感染性慢性代谢综合征，其特点是粉消胰岛素分泌受损和靶组织对胰岛素作用的抵抗而导致的高血糖。据统计，化酶互作Ⅱ型糖尿病是力学世界范围内最常见的糖尿病，占所有糖尿病患者的及相究90%以上，被认为是用研主要的公共卫生问题。预计2030年糖尿病将成为人类第七大致死因素，栀黄制动被公认为“无声杀手”。预计到2035年，受影响的人数将增加到5.92亿。世界卫生组织最近公布的统计数据显示，全世界大约有15亿成年人超重和肥胖，这使他们具有患糖尿病的潜在风险。

在食物消化过程中，淀粉被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶共同作用水解成单糖，抑制这些酶的活性可显著降低餐后血糖升高。抑制淀粉水解和葡萄糖的吸收是预防Ⅱ型糖尿病的有效途径。近些年来，膳食活性成分在预防慢性疾病中的作用受到广泛关注。据统计，目前有800余种植物提取物可能对糖尿病的治疗起积极的作用。关于植物提取物作为淀粉消化酶抑制剂的研究成为热点。栀子是我国治疗糖尿病传统药物，是一种含有多种有效活性成分的药食两用资源，具有抗炎、抗氧化、保护神经等多种药理作用。肖小华等报道栀子黄含量为1.67g/mg时能显著降低不同糖负荷的小鼠血糖，后续研究发现栀子提取物对α-葡萄糖苷酶产生抑制作用的有效部分可能是环烯醚萜和栀子黄色素类。Zhou等通过研究栀子对治疗Ⅱ型糖尿病的动物实验粪便组学从侧面证实了栀子黄的降糖效果。李春英等报道栀子黄抑制α-葡萄糖苷酶活性，然而，具体作用机制不详。本研究探讨栀子黄对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的影响及其作用动力学，通过光谱特征分析两种淀粉消化酶结构变化，揭示栀子黄对餐后血糖升高的抑制作用机制，以期为糖尿病患者功能产品的开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

栀子黄（色价500），河南中大恒源生物科技有限公司；小麦淀粉（含水量12.89%），泰州市好食惠调味品有限公司；α-淀粉酶（50U/mg），美国Sigma公司；α-葡萄糖苷酶（7000000U/mL），上海源叶生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（PNPG），麦克林生化科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸，国药集团化学试剂有限公司。其余试剂均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1600B紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；FA1004电子分析天平，上海上平仪器公司；MultiskanFC96孔酶标仪，赛默飞世尔仪器有限公司；G9800A荧光分光光度计，安捷伦科技有限公司；MVS-1旋涡混合器，北京金北德工贸有限公司；SHZ-82数显水浴恒温振荡器，金坛华峰仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 栀子黄对α-淀粉酶抑制动力学研究

使用米氏方程（Michaelis-Menton）和LineweaverBurk方程确定栀子黄对α-淀粉酶的抑制方式。以小麦淀粉溶液作底物磷酸盐缓冲液溶解后在80℃的水浴锅中糊化30min。淀粉质量分数为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%。栀子黄溶液质量浓度定为0.5，0.7mg/mL。向具塞试管中先加入不同浓度栀子黄溶液250μL，再添加250μLα-淀粉酶溶解液37℃振荡10min，再加入500μL不同浓度的底物溶液，每隔5min取出相对应的试管并加入2.0mLDNS显色剂沸水中加热5min后冷却至室温，定容至25mL，540nm处测量其吸光度。

1.3.2 栀子黄对α-葡萄糖苷酶抑制动力学研究

α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶的试验方法大致相同。栀子黄溶液浓度仍然为0.5，0.7mg/mL，试验中需要将作为底物的PNPG溶液的浓度范围设定为0.5～5.0mmol/L。向96孔酶标板中先加入80μL磷酸盐缓冲溶液按设定加入20μL不同浓度的栀子黄溶液和60U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37℃气浴振荡10min后加入20μLPNPG底物溶液，每隔5min取出酶标板并加入100μL的0.2mol/L的碳酸钠溶液终止反应，用96孔酶标仪在405nm处测定吸光度。具体的方程计算情况与上述的α-淀粉酶的过程相一致。

1.3.3 α-淀粉酶荧光光谱测定

探究不同浓度栀子黄对α-淀粉酶的荧光猝灭光谱。在磷酸盐缓冲液中配置质量浓度0.025，0.1，0.3，0.5，0.7，1mg/mL的栀子黄；将α-淀粉酶（300U/mL）溶解到pH6.8的磷酸盐缓冲液中，在3mL的α-淀粉酶的溶液中加入0.2mL不同浓度的栀子黄漩涡振荡2min定容至10mL。将混合液分别在30℃和37℃的水浴条件下恒温振荡30min。以等量的栀子黄溶液为空白参比，激发波长278nm，发射波长290nm，狭缝宽度5nm，在290～500nm波长范围内进行荧光发射光谱扫描。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶荧光光谱分析

α-葡萄糖苷酶荧光光谱分析与α-淀粉酶类似，其中α-葡萄糖苷酶的酶活力大小为180U/mL激发波长278nm，发射波长290nm，狭缝宽度5nm，在290～450nm波长范围下进行荧光发射光谱扫描。其中的对照试验与上述α-淀粉酶的方法与操作相同。

同步荧光光谱试验与1.3.3节过程大致相同，在上述荧光猝灭试验基础上，将参数改变为：α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶均在波长200～400nm范围内，通过设定激发波长间隔和发射波长间隔在△λ=15～60nm的设定下进行荧光光谱扫描。
酶的抑制动力学可以通过以下方程表示：

Michaelis-Menton方程：

不同I下的双倒数直线得出斜率Slope。利用I和Slope再次作图得出K_ic。方程如下：

将斜率（Slope）或截距（Y-intercept）与I的二次重绘图并进行线性拟合。式（1）、（2）、（3）、（4）中：V—初始反应速度，mg/mL/min；S—底物质量浓度，mg/mL；V_max—最大初始反应速度，mg/mL/min；I—抑制剂质量浓度，mg/mL；α—表观系数；Km—米氏常数；K_ic—竞争性抑制常数；Kiu—非竞争性抑制常数。

荧光猝灭通过Stern-Volmer方程描述：

式（5）中：F₀和F—分别为不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度；Ksv和Kq—分别为Stern-Volmer猝灭常数和受扩散过程控制的双分子荧光猝灭速率常数；[Q]—猝灭剂质量浓度，mg/mL；τ₀—荧光分子平均寿命（α-淀粉酶的τ₀为2.97ns，α-葡萄糖苷酶的τ₀为10^-8s）。

相关链接：α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶，栀子黄，5-二硝基水杨酸

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