甘蓝型油菜乙酰转移酶基因的克隆及功能验证（一）

随着人们生活质量的甘蓝功提高和对食品营养保健功能认识的加强,我国食用植物油的需求不断增加,油菜是我国重要的油料和经济作物之一,菜籽油不仅富含人体所必需的氨基酸和脂肪酸,而且能较长时间地储存,为了更好地满足广大人民对优质食用植物油的需求,菜籽油品质改良已成为当前油菜育种领域的热点。

菜籽油的型油酰转主要成分是脂肪酸,油脂的优劣由脂肪酸决定,而油脂脂肪酸的好坏则主要取决于其碳氢链饱和程度。脂肪酸根据碳氢链饱和与不饱和分为3类:饱和脂肪酸(主要有棕榈酸、菜乙硬脂酸等)、移酶验证单不饱和脂肪酸(油酸、基因芥酸等)和多不饱和脂肪酸(亚油酸、隆及亚麻酸等),甘蓝功有研究表明,预防冠心病的指导方针集中在将饮食中的饱和脂肪和反式脂肪转变为不饱和脂肪,饱和脂肪酸熔点较高,易凝固在血管壁上,从而导致高血压和动脉粥样硬化,且饱和脂肪酸还导致血胆固醇浓度上升,不饱和脂肪酸熔点较低,容易被人体吸收。

本研究以湖南省水稻油菜抗病重点实验室前期对高亚麻酸甘蓝型油菜(Brassicanapus)近等基因系进行的型油酰转miRNA测序结果为基础,筛选到的与脂肪酸代谢相关的bna-miR396及其靶基因乙酰转移酶基因(Acetyltransferasegene,AT)。研究表明,菜乙AT通过催化乙酰基团从乙酰辅酶A(乙酰CoA,AcetylCoA)转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类物质上,参与脂肪酸转化与降解,AT缺失会推迟植物开花时间并降低育性。利用同源基因克隆,移酶验证得到AT基因的2个拷贝,分别构建过表达载体与干扰载体,转化拟南芥,分析转基因拟南芥后代种子脂肪酸组成,探究该基因在脂肪酸合成过程的功能,以期促进甘蓝型油菜脂肪合成分子机理研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料

高亚麻酸甘蓝型油菜近等基因系（低亚麻酸株系575，基因亚麻酸含量为5.1%；高亚麻酸株系574，隆及亚麻酸含量9.8%),甘蓝功野生型拟南芥(WT)由湖南农业大学国家油料改良中心提供。大肠杆菌感受态DH5α,型油酰转限制性内切酶、dNTP、菜乙T4DNALigationKit购自北京擎科生物科技有限公司；pMD18-T载体由本实验室保存；pCambia1300-35s-N1、pCambia1300-RNAi载体购于上海康颜生物科技有限公司；本试验中所用到的引物均由北京擎科合成。

1.2 AT基因克隆

利用数据库进行检索,发现AT基因有2个拷贝,分别在A基因组和C基因组,并以此序列(GSBRNA2T00114025001、GSBRNA2T00148464001)进行后续引物设计(表1),其中5′端酶切位点前的序列用于重组连接。

采用TransZolUP植物总RNA提取试剂盒(北京全式金)提取低亚麻酸甘蓝型油菜株系575自交授粉后20～35d混合种子总RNA,并用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix反转录试剂盒(北京全式金)合成cDNA第一链,以此为模板,进行PCR扩增,扩增体系包含KOD-FX聚合酶1μL,2×PCRBuffer25μL,dNTP(2.5μmol/L)10μL,正反向引物各0.2μmol/L,cDNA小于500ng,用ddH2O补足至50μL。反应条件为98℃2min预变性；98℃10s,60℃30s,68℃2min,35个循环；68℃7min延伸。

经PCR纯化回收后，与pMD18-T载体相连，转化到大肠杆菌中，由北京擎科公司进行测序。

1.3 生物信息学分析

用SnapGene3.2.1将克隆到的靶基因序列翻译成氨基酸，经NCBI数据库BlastP进行鉴定后,预测对应蛋白的一级结构,包括氨基酸组成、理化性质等；分别登录PredictProtein、SOPMATMHMM网站进行蛋白亚细胞定位预测、结构预测、跨膜螺旋区分析；通过SWISS-MQPEL构建蛋白三级结构模型。

1.5 过表达载体与RNAi干扰载体构建

用BamHI和SalI双酶切pCambia1300-35s-N1载体,胶回收，产物进行体外同源重组反应,获得重组质粒。

用XbaI及BamHI双酶切pCambial300-RNAi载体以及各个基因的RNAi片段的PCR产物,具体方法参考刘芳等,并进行改进,胶回收后进行连接,获得重组质粒。测序检验正确后,用PstI和Sal.I双酶切重组质粒及各个基因的RNAi片段的PCR产物,再次进行连接,转化,获得最终的RNAi载体。

将构建好的过表达载体与RNAi干扰载体转入农杆菌中,以野生型拟南芥为受体,进行基因转化,获得T₀种子；用潮霉素筛选T₀拟南芥阳性苗并种植,之后，用PCR鉴定转基因苗,收取得到T₁种子。

1.6 脂肪酸成分测定

采用SP-6890型气相色谱仪、FID检测器、N3000色谱工作站、毛细管色谱柱DB-23对转基因拟南芥T₁种子进行脂肪酸成分测定,对7个主要的脂肪酸成分进行分析,测定时取5个转基因后代株系,每个材料检测约30粒种子。

2 结果与分析

2.1 靶基因与特异干扰片段克隆及检测结果

以低亚麻酸甘蓝型油菜20～35d自交种cDNA为模板,高保真扩增了乙酰转移酶基因的2个拷贝,大小均为1350bp。分别对2个靶基因特异片段进行PCR高保真扩增,得到了目的片段长度大小的DNA片段。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 蛋白质一级结构预测与分析

以SnapGene3.2.1分别对AT基因翻译出来的氨基酸序列,通过ExPASy-ProtParamtool进行理化性质分析表明(表3),AT基因的2个拷贝114与148氨基酸均为449个，分子量约50.5ku,114编码的氨基酸偏中性而148编码的蛋白偏碱性。不稳定系数显示114与148均为稳定蛋白,且亲水性较差，属于脂溶性蛋白。

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