天山雪莲细胞培养技术、化学成分和药理作用研究进展 （二）

1.2悬浮培养

在愈伤组织培养基础上开展悬浮细胞培养技术研究,天山是实现细胞规模化生产、进而实现细胞培养产业化的雪莲细胞必经之路。以提高生物量、培养提高活性物质含量为目的技术究进，研究人员对天山雪莲细胞悬浮培养技术进行了系统的化学和药研究，比较了反应器类型、成分培养体系、理作生物合成前体、用研诱导子类型以及光谱特性等因素对细胞悬浮培养结果的天山影响。

1.2.1反应器类型

应用间歇浸没式小反应器培养天山雪莲细胞，雪莲细胞发现在培养初期0~6d细胞生长缓慢，培养到15d时生物量和黄酮的技术究进产量达到最大值，分别为12.13g/L和620.08mg/L，化学和药生物量只有摇瓶培养的成分2/3；应用气升式反应器培养天山雪莲细胞，发现培养初期0~3d细胞生长缓慢，理作3d后细胞开始快速生长，到第15天时达到最大值11.7g/L，培养过程中黄酮含量除在第3天有一个轻微的上升外，一直呈下降趋势。2种反应器培养雪莲细胞过程中pH和电导率与摇瓶培养相比变化缓慢。

1.2.2培养体系

通过比较不同的基础培养基对雪莲细胞培养的影响，发现MS培养基最有利于细胞的生长，怀特培养基中的细胞黄酮含量最高，而在B5培养基中获得最高黄酮产量。通过考察不同培养基、培养基初始pH、碳源、接种量、植物生长物质含量对雪莲细胞生长和黄酮合成的影响，结果发现，N6液体培养基在pH5.8、蔗糖50g/L、接种量60~80g/L时有利于细胞生长和黄酮合成，附加BA0.2mg/L+NAA2mg/L有利于黄酮合成,而附加BA0.5mg/L+NAA3mg/L则对生长有利。应用培养基MS+NAA5.0mg/L+蔗糖3%，在pH5.8、振荡器转速（120±5）r/min、培养温度（24±1）℃、光照周期12h/d以及光照强度85μmol·m-2/s培养条件下，采用最佳接种质量浓度2.53g/L，在悬浮培养14d时细胞的干重和鲜重均达到最大，分别为16.85、235.28g/L。

1.2.3有机添加物

添加苯丙氨酸和水解酪蛋白能够显著地提高黄酮的合成量，分别比未添加对照提高了47.68%和21.59%；添加椰乳显著地提高细胞生长，生物量比对照提高了36.1%。

1.2.4外源添加碳源和生物合成前体

在每升培养基添加蔗糖50g和生物合成前体L-苯丙氨酸500mg的优选培养条件下，仅需培养16d，紫丁香苷、绿原酸和1,5-二咖啡酰奎尼酸的质量浓度即可以分别达到339.0、225.3、512.7mg/L；三者的含量分别为野生药材的67.9、1.9、10.6倍。

1.2.5添加诱导子

1.2.5.1非生物诱导子

在培养的第14天添加浓度为50μmol/L的一氧化氮，总黄酮量和产量的最大值分别为46.15mg/g和830.7mg/L；在第14天添加浓度为50μmol/L的水杨酸，总黄酮量和产量的最大值分别为46.81mg/g和701.79mg/L；在第6天添加浓度为100μmol/L的茉莉酸甲酯，总黄酮量和产量的最大值分别为52.33mg/g和924.67mg/L。3种非生物诱导子均能促进总黄酮含量和苯丙氨酸代谢途径关键酶PAL活性的增加，除水杨酸外，也能促进细胞生物量的增加。25mg/L的壳聚糖诱导子对生物量没有明显的促进作用，但能显著地促进黄酮的合成，最大的黄酮产量高达1243.5mg/L，比对照提高了33%。

1.2.5.2生物诱导子

5种真菌诱导子F1817、F1832、F1780、F1953、F2563均能促进次生代谢产物总黄酮和紫丁香苷的积累，诱导效果最好的为诱导子F1953，总黄酮和紫丁香苷含量均达到最大值，质量分数分别为46.56mg/g和3.03mg/g。

1.2.5.32类诱导子联合使用

通过非生物诱导子（一氧化氮、水杨酸和茉莉酸甲酯）和生物诱导子（F1817、F1832、F1780、F1953和F2563）的联合诱导提高了天山雪莲细胞有效成分的含量，细胞中总黄酮量最大值为60.41mg/g，是野生药材的3.00倍；培养物中紫丁香苷量达到3.10mg/g，是野生药材的11.48倍。

1.2.6光谱特性

红光最有利于细胞的生长，在红光下获得最大生物量；蓝光最有利于黄酮的合成，在蓝光下获得最大黄酮含量和产量。蓝光加白光的组合有利于黄酮的合成。

1.3毛状根培养

天山雪莲这一品种的细胞培养技术研究主要集中于愈伤组织培养和悬浮细胞培养，毛状根培养的报道较少。付春祥等利用发根农杆菌R1601、R1000、LBA9402感染新疆雪莲的叶片、叶柄和根段外植体，诱导产生毛状根。毛状根接种量为2.8g/L时，20d生长量可达66.7g/L，黄酮含量达到干重的10.23%。冠瘿碱的检测和rolB基因的PCR分析表明，Ri质粒中的T-DNA片段已经整合到毛状根细胞的基因组中。预培养2d的新疆雪莲根段外植体，经过R1601感染后，毛状根的诱导率可达100%，说明预培养时间、外植体类型以及发根农杆菌的菌株属性对毛状根诱导有着重要的影响。乔献丽等研究了外源激素GA3和IAA对3个转基因新疆雪莲类黄酮高产毛状根系C17、C27、C46总黄酮含量的影响，结果表明，与未用激素处理的毛状根相比，外源激素GA3和IAA能显著提高毛状根培养物中芹菜素和总黄酮的含量。毛状根系的组织干重与类黄酮的含量没有相关性。

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