腐植酸调节砷酸盐生菜毒性作用研究（一）

近年来，腐植含砷灌溉水的酸调酸盐生菜使用导致砷污染农田大面出现，农田中的节砷砷进一步通过食物链传递对人体健康造成危害。砷的毒性生物毒性不仅取决于生物体中砷的含量，而且与砷的作用形态密切相关，砷可分为无机砷、研究有机砷和单质砷，腐植其中单质砷溶解度较低，酸调酸盐生菜不易被人体吸收，节砷而无机砷的毒性毒性大于有机砷。在土壤与水环境中，作用可溶性砷形态主要为砷酸盐As（Ⅴ）和亚砷酸盐As（Ⅲ），研究在有氧条件下，腐植As（Ⅴ）占主导地位，酸调酸盐生菜因此本研究选取砷酸盐作为主要研究对象。节砷生菜具有重要的食用价值和药用价值，现已成为设施农业和植物工厂的主要种植对象之一。本研究选取生菜作为研究对象，采用可以排除复杂土壤环境影响的水培方式，从砷酸盐的生菜积累以及对其安全品质影响方面开展研究。

腐植酸（Humicacid，HA）是一种天然存在的高络合和聚合有机物，其丰富的含氧官能团（例如羧酸、酚羟基和醌官能团可以络合许多金属。
采用的腐植酸中的黄腐酸（富里酸）含量≥90%，其分子结构中存在含氧活性基团，如羧基和酚羟基，同时还含有杂氮环，所以有离子交换性和与金属离子形成螯合物的能力，另外含有的醌基和半醌基具有一定的氧化还原能力。黄腐酸能使作物根系发达，次生根数量增多，提高作物吸水力，并能降低叶面蒸腾作用，提高叶绿素含量，促进光合作用。此外，腐植酸还可以提高植物肥力，改善植物生长。因此，本研究进一步选取腐植酸对砷的植物毒性进行调节，旨在从生菜中砷的安全限量的角度，探究蔬菜中砷的累积规律以及砷和腐植酸对蔬菜的毒性调节作用，为蔬菜质量安全及品质改善提供数据，对修订相关标准以及蔬菜的安全生产具有指导意义。

一、材料与方法

1、生菜的培养及染毒

本研究选取玻璃生菜（Lettuce（IcebergL）作为研究对象，采用蛭石将生菜种子培育至四叶一心后，移入水培盆中，每个水培盆种植生菜12株。各水培盆中均装有5L的Hoagland营养液，成分组成见表1。用NaOH调节pH为6.0，并及时补充蒸馏水至5L水位线，定期用充氧泵进行曝气处理，定期测定培养液中砷含量的变化。

为考察不同砷酸盐As（Ⅴ）初始添加浓度对生菜生长的影响，分别设置0.5、1、5、10、30mg·L-1的砷酸盐浓度（分别表示为V-0.5、V-1、V-5、V-10、V-30，V代表五价砷，由于V-30处理组在生菜生长至第10d全部死亡，因此不再作分析），同时设置空白对照组（CK），以及不添加植物空白对照组（NP）。

为研究腐植酸对生菜砷胁迫的影响，选取V-10处理组，分别添加1、5、10mg·L^-1的腐植酸（分别表示为V10HA1、V10HA5、V10HA10，HA代表腐植酸），同时设置腐植酸的空白添加实验，在不添加砷的营养液中分别添加腐植酸5、10mg·L-1（1分别表示为CKHA5、CKHA10）。其中腐植酸分子式为C9H9NO6，CAS：1415-93-6，黄腐酸（富里酸）含量≥90%。为考察不同生长期生菜生长表现，分别在生菜生长早期（生长至第10d，Day10）、中期（生长至第20d，快速生长期，Day20）、收获期（生长至第30d，生长趋于稳定，Day30）时，随机选取生菜样品3株，采用便携式叶绿素仪（SPAD-502，MinoltaCamera，Osaka，Japan）对应测定叶片的SPAD（Soilandplantanalyzerdevelotrnent）值，每个处理组测定30次取平均值。采集生菜样品，分别进行植物鲜质量、株高、根长的测定。

2、pH、砷总量及砷形态的测定方法染毒前，统一调节各实验组中培养液pH为6.0。

在生菜3个对应生长期，进行pH测定，并进一步采集10mL培养液，进行适当稀释后，测定培养液中的砷总量及形态。

在生菜不同生长期，从每个处理组中随机采集生菜样品3株，使用陶瓷剪刀将其剪碎并混匀。同时各植株分别称取根、茎、叶样品2g，每个样品制备两份，其中一份用于生菜中砷形态的测定，将样品研磨后加入10mL提取剂（磷酸缓冲盐：2mmol·L^-1磷酸氢二铵和0.2mmol·L^-1EDTA），250r·min^-1振荡20min，8000r·min^-1离心5min，上清液经0.45μm水系滤膜过滤后，上机测定。另外一份置于消解管中，加入10mL浓硝酸过夜，置于电热消解仪上进行消解，升温至120℃加热0.5h，后升温至150℃继续加热3h，再调至170℃赶酸至0.5mL，待消煮管内液体冷却后定容至10mL，上机测定。

溶液及生菜中砷形态的测定采用HPLC-ICP-MS（HPLC：Agilent1100；ICP-MS：AgilentTechnologies7700Series），流动相为20mmol·L^-1柠檬酸+5mmol·L^-1己烷磺酸钠，采用NaOH调节pH为4.3，进样量为20μL，流速为1mL·min^-1，测定过程中，通过添加质控、监控点以及复测方式进行质量控制。

3、生菜品质指标测定方法

为研究不同处理组在生菜快速生长期营养品质变化，采用维生素C、可溶性糖、硝酸盐、总酚测定试剂盒进行生菜品质指标的测定，试剂盒均由南京建成生物有限公司提供。氨基酸的测定采用SykamS433D型氨基酸自动分析仪进行，氨基酸的提取采用王丽的方法。

4、数据统计分析

除另有说明外，每个实验设置3个平行。采用SPSS22.0对数据进行单因素方差分析，通过T检验，当P＜0.05时，认为具有显著差异。同时采用SIMCA14.1软件对氨基酸差异分布进行PLS-DA分析。

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