基于高通量测序技术分析黄酒微生物多样性的研究进展

黄酒是基于酒微进展我国的传统特产，主要以谷物为原料，高通加入麦曲、量测酵母等进行发酵而成。序技析黄性黄酒发酵环境开放，术分生物在酿造过程中微生物群落结构复杂，多样含有各种霉菌、研究细菌及酵母，基于酒微进展且酿造过程中产生的高通各种酶类，能够降解大分子物质，量测促进黄酒风味物质的序技析黄性代谢合成，赋予黄酒丰富的术分生物营养成分和独特的风味。因此，多样对黄酒酿造过程中微生物组成进行系统性研究，研究有利于深入了解黄酒发酵机理，基于酒微进展对实现黄酒产业的高品质和健康发展具有重要意义。

早在1904年，日本学者就对绍兴黄酒酿造中的微生物多样性展开了研究，至今已有百余年。起初对微生物多样性的研究主要采用传统培养技术，该技术操作简单且可直接获得分离出的目标微生物，是分析微生物群落结构多样性最基本的方法。但是，该方法工作量大，且仅能够筛选出少量微生物，大部分微生物因不能培养而遗漏，造成检测的微生物群落结构不准确。随着现代分子技术的发展，越来越多的研究人员开始采用非培养技术来研究复杂环境体系中的微生物群落。高通量测序技术作为一项全新的测序技术，能够平行、全面地分析不同样本的群落结构，具有通量高、测序速度快、数据准确等优点，已被广泛应用于各种微生物系统多样性的检测和研究中。近年来，高通量测序技术也逐渐被应用到传统发酵食品中微生物多样性的研究，如奶酪、白酒、黄酒和泡菜等。本文在介绍高通量测序技术的基础上，分析其在黄酒微生物多样性研究中的应用情况，旨在为黄酒发酵机理及品质调控等相关领域的深入研究提供理论指导。

1高通量测序技术简介

高通量测序（HighThroughputSequencing,HTS）又称为下一代测序技术（NextGenerationSequencing,NGS），是基因测序领域的一大革命性创新，极大地拓宽了环境微生物分析的领域。该技术使用通用接头，与片段基因组DNA相连接，随后使用不同的方法实现PCR拷贝。之后可同时大规模地进行引物杂交和酶的延伸反应，实现对几十万至几百万条DNA分子的序列测定，同时检测每一步反应产生的信号，由此获取测序数据，最终通过计算机分析获取完整DNA信息。根据其原理不同，可分为聚合酶合成测序和连接酶合成测序两类。通常，高通量测序平台主要包括Roche454焦磷酸测序平台、Illumina测序平台、ABISOLiD测序平台、IonTorrent测序平台和PacBioSMRT测序平台等。其中，Roche454和Illumina测序平台是目前应用最广泛的测序平台。

1.1Roche454测序平台

Roche454测序平台是以4种酶（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶）为核心的催化酶级联反应，以5’-磷酰硫酸和荧光素为底物，加入待测DNA单链和引物的总体系。在退火过程后，利用上述4种酶的协同作用，将dNTP的延伸和与之相对应的荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光信号的强度，达到实时记录DNA序列的目的。该测序平台的优点是测序读长较长、耗时短，但也存在着成本较高，样本制备复杂等劣。

1.2Illumina测序平台

Illumina测序平台的基本原理为单分子簇边合成边测序和dNTP可逆终止化学反应。首先将基因组DNA处理成单链状态，单链DNA在固相的表面经过桥式扩增，形成单分子簇，用作测序模板。后续反应中，加入荧光可逆终止子dNTP，由于dNTP3’端有识别的切割位置，每个循环只增加单个碱基。将不同碱基上的荧光标记所激发的不同的信号进行捕获，从而得知模板DNA的序列。Illumina在二代测序中通量最高，测序成本最低，但其读长较短。

1.3ABISOLID测序技术

ABISOLID测序技术核心是4种荧光标记寡核苷酸的连接反应测序，其基本原理为通过乳液PCR和磁珠富集形成文库，与Roche454的原理基本相同。随后进行多轮测序反应和每轮多次连接反应，连接测序所用的底物是8个碱基荧光探针混合物，根据序列的位置，样品DNA即可被探针标记。DNA连接酶优先连接和模板配对的探针，并引发该位点的荧光信号的产生。并且每个位点实现2次扫描，使得准确率可达99.94%。SOLID在测序通量和精准度上优势明显，但也存在读长短、成本高等劣势。

1.4IonTorrent

IonTorrent在2011年被《Nature》所报道，是第一个不需要光学系统的，使用半导体芯片在化学和数字信息之间建立直接的联系的技术，被称为介于第二代和第三代之间的测序平台。其原理为，在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次掺入A、T、C及G。通过检测碱基配对时，氢离子的释放引起pH的变化，利用芯片将化学信号转换为数字信号，从而读出DNA序列。该技术操作简单、成本低、耗时短，但也存在通量较低的缺点。

2高通量测序技术在黄酒微生物多样性分析中的应用

多种微生物混菌发酵是黄酒酿造的最大特点，发酵过程中各个环节都会带入种类不同的微生物。通过对其中微生物多样性的检测，能够为黄酒酵造工艺的改良提供理论指导。近些年，许多学者将高通量测序技术应用于黄酒微生物多样性的研究。本文将对研究者们利用高通量测序平台，对黄酒酿造的不同工艺流程中微生物多样性的研究结果进行归纳。

2.1浸米水中微生物多样性分析

浸米是黄酒酿造的首道工序，也是重要的工艺流程之一。通过浸米过程，让大米吸足水分便于蒸煮，以保障发酵的顺利进行与风味产生。浸米水中微生物种类丰富，大量的微生物及其代谢产物对黄酒的风味和品质有重要影响。朱小芳等通过Illumina高通量测序技术，对上海金枫酒业股份有限公司提供的浸米水中细菌群落结构进行分析。结果显示，乳酸菌属、片球菌属、醋酸菌属和不动杆菌属为浸米水中的主要微生物，其中乳酸菌属丰度含量可达60.67%，乳酸菌属中57.4%为植物乳杆菌，21.1%为短乳杆菌。在浸米过程中，这些乳酸菌不仅能分解淀粉、蛋白质等大分子物质，供给酵母发酵产酒精，还会自溶分解为多肽、少量氨基酸和其他成分，促进黄酒的呈香呈味，增强黄酒口味的丰满性和浓厚感。

2.2麦曲微生物多样性分析

麦曲是黄酒酿造中的重要原料，由原麦自发发酵而成。麦曲微生物群落较为复杂，含有各种霉菌、细菌及酵母，是黄酒发酵中微生物最重要的来源，这些微生物很大程度上决定了黄酒的风味、口感。

目前，已有较多学者利用高通量测序技术对麦曲中真菌群落结构进行研究。从研究结果来看，麦曲中真菌主要为根霉菌、曲霉菌、毛霉菌和镰刀菌。另外，细菌在黄酒发酵过程中发挥着同样重要的作用，因此对麦曲中细菌的群落结构进行分析是准确阐述黄酒发酵微生物作用机制的前提，对提高麦曲及黄酒品质有重要意义。利用高通量测序技术分析麦曲中细菌结构已有一定研究，发现细菌中的优势菌群普遍以芽孢杆菌属、葡萄球菌属和糖多孢菌属为主。但是，由于年份、产地以及处理环境的不同，检测出的优势菌种存在一定差异，统计结果见表1。

2.3黄酒发酵过程中微生物群落变化分析

黄酒发酵是决定酿造品质极为关键的一环。发酵过程中，微生物种类丰富，代谢活跃，发酵液中酒精浓度上升、氧气含量下降以及多种微生物代谢产物的大量累积，使得微生物结构也在发生明显的变化。目前研究者们普遍认为，黄酒中风味物质主要是由原料投入和微生物发酵所产生，因此对于黄酒发酵过程中微生物动态变化的研究尤为重要。发酵的整个过程分为前发酵时期和后发酵时期，期间群落组成的快速变化，使得传统的微生物培养方式不能及时测定某一时刻微生物的群落结构，同时还会出现大量微生物因无法培养而被遗漏的情况。分子生物学技术的快速发展，为环境中微生物的解析带来了极大的便利，尤其是高通量测序技术的利用，能够高效地对发酵过程中微生物群落的动态变化进行监测。

在基于高通量测序的黄酒发酵过程中微生物群落变化分析中总结发现，细菌的优势菌群为糖多孢菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属，而FANGRuosi等所检测出的泛菌属并未在其他报告中有所显示；真菌的优势菌群普遍为曲霉属微生物，刘芸雅研究报告中指出其相对丰度最高，达到84.00%～98.95%，同样在牟穰的报告中，曲霉菌的相对丰度从第0d的95.09%上升到第24d的99.67%，可见曲霉菌在酿酒过程的真菌菌群中占绝对的优势。同时将多项研究对比发现，黄酒发酵液中微生物多样丰富，发酵过程中微生物多样性整体呈下降趋势，并且不同类群的丰度变化情况也呈现多样性。详细数据对比如表2所示。

2.4陈酿过程中微生物分析

陈酿是优质黄酒生产中必不可少的工艺环节，素有“酒是陈的香”的说法。新酿成的黄酒，营养物质丰富却不稳定，在贮存陈酿过程中常出现酸败变质的现象，从而对黄酒产业造成较大的经济损失。近些年，研究者通过高通量测序手段对黄酒酸败的关键微生物进行解析，为黄酒陈酿过程中酸败微生物的控制提供了可靠的理论依据。刘文容等利用IlluminaMiSeq技术对分离的微生物进行16SrRNA鉴定，结果显示细菌的优势菌群为乳酸杆菌属，并确定出绝对优势微生物为耐酸乳杆菌或食果糖乳杆菌。将这两种微生物进行全基因组对比，鉴别出的36株待测微生物中包括28株耐酸乳杆菌和8株食果糖乳杆菌，均可使黄酒总酸含量升高，其中耐酸乳杆菌产生的影响更大。对于难培养微生物的快速分析，高通量测序技术无疑提供了一个有效的解决途径。通过这种技术，能够准确且高效地检测微生物的种类。

3结语

近年来黄酒产业发展缓慢，黄酒酿造工艺和风味的创新与改良也需要更多专业的研究成果指引。相较于白酒、葡萄酒微生物的研究，我国在黄酒微生物上的研究相差甚远。黄酒酿造过程的微生物群落呈现出动态的变化，传统的方式在筛选、培养和操作上有很大的局限性。得益于高通量测序技术在检测微生物多样性中的应用，该方面的研究在时间、成本和准确性等方面有了明显的改观，大大地减少了不必要的耗费，并且能够更全面地构建微生物群落体系。同时，随着第三代测序技术的逐渐发展，高通量技术在测序时间和测序长度上有着明显的提升，相信也将逐步应用于黄酒微生物多样性的研究之中，为我国黄酒产业健康发展提供更多的理论指导。

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