探针标记物与标记方法（二）

5、探针碱性磷酸酶和辣根过氧化酶系统

除了直接的标记荧光标签如荧光素碱性蕊香红、香豆素(Coumarin)或它们各自的物标衍生物外，最常使用的记方非放射性指示剂系统是用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)作为标志酶。探针在简单的标记一步反应中，它与寡脱氧核苷酸直接结合，物标寡脱氧核苷酸的记方5’位置与AP的偶合是以双功能键作为媒介。用辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase，探针HRP)直接标记寡核苷酸效率低，标记因此：HRP主要用于标记多核苷酸片段。物标直接标记的记方AP探针，能达到与放射性标记或间接非放射性标记寡核苷酸同样高的探针特异性，这是标记因为AP虽然必须与每单个寡核苷酸探针结合，但是物标它省略掉间接系统中特定的探针修饰基团与相结合成分之间的结合反应，就是用AP修饰具有确定序列的寡核苷酸的例子。被检测的样品经琼脂糖凝胶电泳和膜印迹后，所形成的序列梯状带能直接地被用AP催化的光学反应或发光反应观察到。

二、探针标记方法

(一)探针的放射性核素标记法

这里主要以放射性核素豫P为例，介绍核酸探针与标记的连接方法(标记方法)。其他核素的标记方法与之相似，可参照此进行。

1、缺口平移法

缺口平移法(Nick translation)的原理是：将DNA酶I(DNase I)的水解活力与大肠杆菌DNA聚合酶I(DNA pol I)5’→3’的聚合酶活力和5’→3’的外切酶活力结合。首先用适当浓度的DNase I在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E．coli的DNA pol I 5’→3’的外切酶活力，切去带有5’-磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚合酶活力，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。DNA聚合酶I的这两种活力交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸所取代，成为带有标记的DNA探针，经纯化除去游离的脱氧核苷酸，即成纯化的标记DNA探针。缺口平移标记法可对环状或线状双链DNA进行标记。

需要注意的是，DNase I活性控制到什么程度是缺口平移标记法成败的关键，另外，缺口平移标记法产生的探针是双链DNA，用时要预先变陛后再使用。

2、随机引物法

随机引物(Random priming)是含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片段混合物，因此它可以与任意核酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。目前市售的试剂盒中，随机引物是用人工合成方法得到的，寡核苷酸片段长度为6个核苷酸残基，含有各种可能的排列顺序(4⁶=4096种排列顺序)。

将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物(一些六聚核苷酸)一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(E．coli DNA polymer-rase I Klenow Fragment)的催化下，按碱基互补配对的原则，不断在其3’-OH端添加同位素标记的单核苷酸(α一³²P—dNTp)修补缺口，即形成放射性核素标记的DNA探针。

除能进行双链DNA标记外，随机引物法也可用于单链DNA和RNA探针的标记。当采用单链DNA片段或RNA作为模板时，必须注意所得到的标记探针并不是其本身，而是与其互补的单链DNA片段。如果需要其本身作为探针，则必须采用其互补链或双链DNA作为模板。当以RNA为模板时，操作方法同上，但必须采用反转录酶，得到的产物是标记的单链cDNA探针。此法得到的探针放射活性极高，而高放射性会造成DNA链的破坏，因此标记的DNA探针应立即使用。

3、单链DNA探针的标记

单链DNA探针与双链DNA探针相比，其杂交效率更高。这是由于双链：DNA探针在杂交时，除与目的基固序列杂交外，双链DNA探针两条链之问还会形成自身的无效杂交；而单链DNA探针避免了这种缺点，主要适用于克隆于M13噬菌体中的DNA片段的标记。选用适当的引物也可用于质粒DNA中插入顺序的标记。

一般采用M13噬菌体体系进行单链DNA探针的标记。人工合成的寡核苷酸作为引物，首先与克隆了特异基因片段的M13噬菌体DNA杂交，在α-³²P-dNTP的存在下，利用E．coli DNA polymerase I Klenow片段的链延伸反应，合成高放射性的单链DNA探针。用适当的限制性内切酶切取所需探针序列，然后用变性胶电泳分离得到单链DNA探针。双链RP型M13DNA也可方便地用于单链。DNA探针的制备，选择适当的引物可得到相应的正链或负链DNA单链探针。作为引物的寡核苷酸，一般采用互补于M13噬菌体多克隆位点3’端序列的“通用引物”(正链引物：5’-CACAATTCCACACAAC-3’，负链引物：5’-TCCCAGTCACGACGT-3’)；也可以人工合成一段互补于插入序列的寡核苷酸片段作为引物。

4、cDNA探针的标记

来源于鸟类髓母细胞病毒(AMV)的反转录酶，是一种依赖于RNA的DNA聚合酶，具有多种酶促活性，包括5’→3’DNA聚合酶活性及RNA／DNA杂交体特异的RNase H酶活性。此酶主要应用于将mRNA反转录成cDNA而应用于cDNA克隆，亦可用于RNA或单链。DNA模板的强P标记探针的制备。当以poly(A)mRNA为模板时，反转录酶的引物可以是oligo-dT，也可采用特异的寡核苷酸引物，还可采用随机寡核苷酸作为引物。反转录得到的产物：RNA／DNA杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速降解成小片段，经Sephadex G-50柱层析即可得到单链DNA探针。

5、寡核苷酸探针的标记

人工合成的寡核苷酸片段作为分子杂交的探针，已日益为更多的研究者所青睐。利用寡核苷酸探针，可以检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。多种酶促反应可用于寡核苷酸探针的末端标记，如T4多核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶、末端脱氧核苷酰转移酶等。

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